Содержание

Герпес-вирус человека 1 и 2 типа (вирус простого герпеса 1 и 2 типа), определение ДНК, типирование (Human herpesvirus 1, 2, Herpes simplex virus 1, 2 (HSV-1, HSV-2), DNA) в соскобе эпителиальных клеток кожи

Метод определения ПЦР с детекцией в режиме реального времен».

Исследуемый материал Соскоб эпителиальных клеток кожи

Доступен выезд на дом

Раздельное определение ДНК-вируса простого герпеса 1 типа (губного или лабиального) и 2 типа (генитального) в соскобах эпителиальных клеток кожи методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени. 

Термин «герпес» (от древнегреч. – ползти, ползучий) возник ещё в древнем Риме. Но именно сейчас скорость распространения этого заболевания опережает темпы прироста населения Земли. Частота инфицирования вирусом простого герпеса второго типа в Европе достигает 44%. Герпес занимает второе место по распространенности среди заболеваний, передающихся половым путем, после трихомониаза и второе место после гриппа по смертности от вирусных инфекций. 

Вирусы простого герпеса первого (ВПГ-1) и второго (ВПГ-2) типа относят к семейству герпес-вирусов (Herpesviridae), общим свойством которых является постоянное персистирование в организме после инфицирования. Эти вирусы попадают в организм через слизистые (обычно «входные ворота» для ВПГ-1 – слизистые ротовой полости и носоглотки, для ВПГ-2 – слизистые половых органов). Клинические проявления герпетической инфекции в любой форме (высыпания на коже и слизистых оболочках, симптомы поражения нервных клеток и др.), как правило, свидетельствуют о снижении иммунитета. Первичная герпетическая инфекция и реактивация инфекции (в гораздо меньшей степени) в период беременности могут вызывать патологию беременности, внутриутробное инфицирование плода или инфицирование ребенка во время родов.

 

Возможность определения типа вируса простого герпеса − достижение лабораторной диагностики последних лет. Это позволяет уточнить особенности патогенеза заболевания, разработать методы профилактики, программы терапии и предупреждения рецидивов. Хотя оба типа ВПГ могут вызывать аналогичные клинические проявления, всё большее значение приобретает их дифференциальная диагностика. Так ВПГ-1 в настоящее время представляется как один из факторов риска возникновения болезни Альцгеймера. Аногенитальная герпетическая инфекция, обусловленная ВПГ-2, по сравнению с ВПГ-1 характеризуется большей частотой развития рецидивов. Вирус простого герпеса второго типа, по-видимому, связан с раком шейки матки и раком влагалища и повышает восприимчивость к ВИЧ-инфекции. Для терапии вируса простого герпеса второго типа разработан и применяется специфический иммуноглобулин (IMMUNOGLOBULINUM CONTRA HERPES VIRUS SIMPLEX TYPUS 2 HUMANUM).

Аналитические показатели:


  • определяемый фрагмент − специфичные участки ДНК герпесвирусов 1 и 2 типов;
  • специфичность определения − 100%;
  • чувствительность определения − 100 копий ДНК герпесвирусов 1 и 2 типов в образце.

Герпетическая инфекция: мифы и профилактика  

Опубликовано: 27.11.2020 13:33

Герпес — вирусное заболевание с характерным высыпанием сгруппированных пузырьков на коже и слизистых оболочках.

Это наиболее распространенное вирусное заболевание, возбудителем которого является ВПГ, то есть вирус простого герпеса. Семейство вирусов «Herpesviridae» может вызывать опасные для жизни болезни, инфекции, рецидивирующие заболевания, трансплацентарные инфекции, которые могут быть причиной врожденных уродств у детей.

С наступлением холодов людей с характерными сыпями на губах появляется все больше и больше. Казалось бы, это нередкое и нисколько не загадочное заболевание, однако среднестатистический пациент ничего не знает о герпесе – разве что «это такая лихорадка на губах».О герпесе писал еще Геродот за сто лет до нашей эры: именно «отец истории» дал герпесу современное название (от греческого «herpein» – ползать) – из-за способности герпетических язв «расползаться» в разные стороны от первичного пузырька на коже. За много веков «общения» с герпесом это заболевание обросло мифами.

Миф 1. Герпес не заразен. С точностью да наоборот. Герпес передается воздушно-капельным (при кашле, чиханье, разговоре), контактным (при поцелуях, пользовании общей посудой, помадой) и половым путями. Возможно, также заражение ребенка от матери при прохождении через родовые пути. Обычно, это случается, если мать заразилась генитальным герпесом на третьем триместре беременности. При этом в ее организме не успевают произвестись антитела, которые она передает ребенку. А если есть повреждение плаценты, ребенок может заразиться в утробном периоде развития – такой герпес называется врожденным.

Миф 2. Герпес – проявление «простуды». В действительности герпес – это самостоятельное заболевание, которое предопределяет вирус простого герпеса. Обычно он активизируется при переохлаждении, стрессе, переутомлении, обострении хронических заболеваний или снижении общего иммунитета.

Миф 3. Если появились сыпи на губах, простуда пошла на убыль. Распространенная точка зрения, однако, не имеет ничего общего с действительностью. В действительности появление сыпи означает, что перенесенная респираторная инфекция ослабила иммунитет, и это дало вирусу герпеса возможность активно действовать.

Миф 4. Если сыпь прошла – герпес вылечен. Это было бы очень здорово, но, к сожалению, удалить вирус из организма невозможно. Он остается с человеком на всю жизнь, и можно лишь заставить его находиться в «спящем» состоянии. Поэтому вирус герпеса есть у 95% людей, причем большинство приобретает его в возрасте 3-4 лет, но проявление его лишь в около 20% людей.

Миф 5. Заразиться герпесом можно только при наличии сыпи. Действительно, в активной фазе болезни выделяется большее количество вирусных частиц и вероятность заражения более высокая. Но передача инфекции может быть в любой момент через невидимые микротравмы кожи и слизевых оболочек.

Миф 6. Герпес на губах (лабиальный) и на половых органах (генитальный) – это два абсолютно разных заболевания, при оральном сексе заражения не происходит. Это правильно лишь частично. Действительно, лабиальный герпес обычно предопределен первым типом вируса простого герпеса (ВПГ-1), а генитальный – вторым (ВПГ-2). Однако оба типа вируса могут привести к сыпи и на губах, и на гениталиях. Особенно часто такое изменение «местожительства» происходит как раз при оральном сексе.

Миф 7. Презерватив полностью защищает от заражения генитальным герпесом. Презерватив действительно снижает риск заражения, но стопроцентной гарантии, к сожалению, не дает. Передача вируса может состояться через участки тела, не закрытые презервативом, или через определенные дефекты «резинового друга» (например, некачественный или излишне пористый).

Миф 8. Наилучшее лечение – прижигание спиртом, йодом или зеленкой. Прижигание не влияет на вирус герпеса и его активность, а вот обжечь поврежденную кожу и слизистую оболочку таким способом очень легко.

Лучше аккуратно смазать сыпи антисептиком, который не содержит спирта, чтобы не присоединилась гнойная инфекция. Проявления герпеса лечат специальными противовирусными препаратами, например, ацикловиром, который препятствует размножению вируса. При частых обострениях используют лекарства, которые стимулируют иммунитет, и общеукрепляющие средства.

Миф 9. Герпес – безопасное заболевание, и поражает только кожу. Вообще-то, герпес занимает второе место по смертности от вирусных инфекций, уступая только ОРВИ. Вирус простого герпеса встраивается в геном нервных клеток, поэтому сыпь возникает в местах нервных окончаний и сопровождается сильной болью. Теоретически герпес может оказаться везде, где есть нервная ткань, а значит – практически в любом органе. При снижении общего и местного иммунитета герпетическое воспаление может развиться в слизистой оболочке рта и гортани, роговице и конъюнктиве глаза, лимфатических узлах, внутренних половых органах, кишечнике, печени, почках, легких и центральной нервной системе.

При поражении головного мозга большинство больных умирают или остаются инвалидами.Кроме того, при врожденном герпесе вероятны множественные изъяны развития и даже смерть младенца, а генитальный герпес значительно повышает риск относительно развития рака шейки матки у женщин и рака предстательной железы у мужчин.

Как не заразиться герпесом

  • Сурово соблюдайте правила личной гигиены. Лабиальный герпес — инфекционное заболевание! Тщательным образом мойте руки с мылом до и после контакта с герпесом, после нанесения антивирусного крема.
  • Не касайтесь руками глаз! Это особенно касается женщин, поскольку они делают макияж.
  • Не используйте слюну для увлажнения контактных линз.
  • Не касайтесь участков, пораженных герпесом! Невзирая на сильный зуд и боль, ни в коем случае не касайтесь герпетической сыпи, не целуйтесь, особенно с детьми, не пользуйтесь чужой помадой и никому не одалживайте собственную, не делите одну сигарету с приятелем.
  • Не пытайтесь избавиться волдырей или снять струпья, во избежание попадания инфекции на другие участки тела.
  • Откажитесь от орального секса. Оральный секс с герпесом губ может вызывать генитальный герпес у вашего партнера.
  • Пользуйтесь отдельным полотенцем и посудой, не пейте из чужих стаканов.

 

ГБУЗ «Центр медицинской профилактики» министерства здравоохранения Краснодарского края.

Лечение вирусных инфекций в ЕМС

Рассказывает дерматовенеролог, врач высшей категрии Артур Иванов

 

Основным путем заражения урогенитальными формами вируса папилломы человека (ВПЧ) и вируса герпеса является половой контакт, включая орально-генитальныую и анальную формы. Возможно заражение новорожденных при родах, что является причиной возникновения ларингеального папилломатоза (образование папиллом в гортани) у детей и аногенитальных бородавок у младенцев; герпетического стоматита и дерматита при заражении вирусом простого герпеса.

К основным факторам риска инфицирования относят: раннее начало половой жизни, частую смену половых партнеров, игнорирование использования барьерной контрацепции (презерватив), наличие других инфекций, передаваемых половым путем (хламидиоз, гонорея, трихомониаз, кандидоз, и др.), внутренние факторы (авитаминоз, снижение иммунитета, в том числе на фоне беременности, стрессы).

Основными клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции (ВПЧ) гениталий являются остроконечные кондиломы и кондилломатоз (одиночные или множественные образования, их обширное распространение и слияние). Это доброкачественные высыпания, которые локализуются в основном в местах перехода малых половых губ, влагалища, шейки матки, устье уретры, область ануса, кожных покровов и на слизистых.

В случае длительной активности ВПЧ в толще кожи или слизистых оболочек, а также при наличии отдельных разновидностей вирусов высокого онкориска, возможно формирование предраковых и раковых изменений, так называемых дисплазий разной степени тяжести или карцином. Наиболее часто ВПЧ провоцирует развитие рака шейки матки, рака шейки мочевого пузыря, прямой кишки, полового члена, рак ротоглотки.

На первом этапе необходимо провести точную диагностику папилломавирусной инфекции (ВПЧ), которая должна включать определение типа вируса и группу онкологического риска, цитологическое и гистологическое исследования, кольпоскопию.

Вторым шагом является полноценное лечение ВПЧ. Это различные методы удаления высыпаний (криодеструкция, электро-, лазеро-, радиоволновая деструкция, в некоторых случаях и хирургическое иссечение).

Третьим шагом является своевременная профилактика возникновения злокачественных образований, вызванных ВПЧ — вакцинация и иммунотерапия.

Согласно рекомендациям СDС (Центра по Контролю за Заболеваниями, США) применение вакцины рекомендовано даже при отсутствии вирусоносительства.

В клинике Дерматовенерологии и Аллергологии-Иммунологии ЕМС  успешно применяется вакцинопрофилактика с целью предотвращения заражения типами вируса папилломы человека высокого онкориска (6,11,16,18), при помощи вакцины «Гардасил» (Gardasil) производства Merck&Co. , Германия.

Кроме того, врачи-венерологи ЕМС проводят вакцинацию пациентов, которые уже являются носителями ВПЧ.

Исследования, проведенные нашими зарубежными коллегами, подтверждают высокую эффективность вакцинации, способствующей более быстрому выведению вируса из организма и обеспечивающую значительное снижение риска возникновения рецидивов клинических проявлений папилломавирусной инфекции. Это позволяет многократно усилить воздействие антивирусной терапии.

Второй по частоте появления среди вирусных инфекций — вирус простого герпеса. Возбудителем является вирус простого герпеса (ВПГ). Причем это может быть, как ВПГ-2 (второго типа), так и ВПГ-1 (первого типа), которые поражают кожу и слизистую оболочку губ, глаз, носа и др. Основные клинические проявления герпетической инфекции гениталий — ограниченные «пузырьковые» высыпания. Причем первый контакт с вирусом простого герпеса может проявиться появлением обильной пузырьковой сыпи, нарушением общего состояния, повышением температуры тела, увеличением лимфатических узлов. В случаях рецидивирования герпетической инфекции высыпания характеризуются сгруппированными пузырями на фоне обширного отека. Главными симптомами, беспокоящими пациентов, являются жжение или выраженный зуд, значительно снижающие качество жизни.

Заражение вирусом простого герпеса происходит от больного человека с клиническими проявлениями активности инфекции.

Для диагностики герпетической инфекции используют молекулярно-генетические методы (ПЦР), серологические методы (определение антител в крови пациента к 1 или 2 типу вируса простого герпеса).

В ЕМС существует возможность быстрого и полноценного обследования пациентов с герпетической инфекцией, определением титров антител к конкретному типу вируса и противовирусного иммунитета у каждого конкретного пациента. Это позволяет подобрать необходимое лечение, которое обеспечит значительное снижение числа рецидивов.

Лечение часто рецидивирующего генитального герпеса — сложная задача. Согласно европейским протоколам лечения, пациенту рекомендован длительный прием противовирусных препаратов. Длительность терапии подбирается индивидуально и может занимать большой промежуток времени.

В ЕМС практикуется индивидуальный подход к каждому пациенту, что позволяет подобрать полноценное лечение и минимизировать проявления побочных эффектов терапии. В случае доказанного факта снижения иммунитета используется иммуномодуляторы (препараты, корректирующие уровень иммунной системы). Наиболее эффективны в данном случае интерфероны и их производные.

В ряде случаев, при наличии противопоказаний к длительному приему противовирусных препаратов, используется терапия герпетической вакциной, что обычно не приводит к элиминации вируса простого герпеса, но позволяет значительно уменьшить количество рецидивов заболевания, вплоть до полного их исчезновения.

Активная на протяжении длительного времени герпетическая инфекция гениталий, особенно у мужчин, может приводить к бесплодию и формированию синдрома хронической тазовой боли.

Бережно относитесь к своему здоровью.

лечение в Москве, диагностика и симптомы

Герпес – распространенная вирусная инфекция, которая характеризуется образованием на коже маленьких сгруппированных пузырьков, заполненных жидкостью.

Герпетическая инфекция вызывается вирусом простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ-1, ВПГ-2). Оба типа вируса могут быть ответственны за поражение кожи лица преимущественно вокруг рта, губ, а также области гениталий.

Симптомы герпесвирусной инфекции

Выделяют несколько периодов развития герпетической инфекции:

  • Покалывание и зуд. Многие пациенты жалуются на покалывание в области, в которой через несколько дней образуются маленькие пузырьки, заполненные прозрачной жидкостью.
  • Стадия образования герпетических волдырей. Мелкие пузыри, заполненные в начале прозрачной жидкостью, постепенно приобретают желтый оттенок, начинают сочиться, и затем ссыхаются.
  • Стадия формирования корочки. Волдыри начинают постепенно покрываться коркой. Не следует самостоятельно отдирать корочку, в этом случае могут формироваться длительно заживающие язвочки, которые вновь покрываются корочкой.

Следует отметить, что первый эпизод герпеса может сопровождаться следующими симптомами:

  • Повышение температуры тела
  • Болезненность в горле
  • Головная боль
  • Мышечная боль
  • Увеличение лимфатических узлов в зоне высыпаний

Причины возникновения герпеса: как происходит заражение

Герпес является высоко заразной инфекцией и передается, как правило, при тесном телесном контакте: поцелуях, половом контакте, орогенитальном контакте. Использование общей посуды, бритвы, полотенец повышают риск заражения.

После первоначального заражения вирус может никак себя не проявлять, находиться в «спящем состоянии» в клетках нервной системы, и активизироваться только спустя время под влиянием таких факторов, как охлаждение либо перегревание организма, хронический стресс, изменения гормонального фона, травмы кожи.

Часто рецидивирующая герпесвирусная инфекция может свидетельствовать о нарушениях в работе иммунной системы.

Диагностика и лечение герпеса

Как правило, врач подтверждает герпетическую инфекцию после опроса пациента и осмотра кожного покрова. Врач может взять образец жидкости из волдыря с целью лабораторного подтверждения диагноза.

Основную терапию герпетической инфекции проводит врач-инфекционист.

Следует отметить, что важным в лечении герпеса является междисциплинарной подход, поскольку герпетическая инфекция может поражать многие органы и анатомические структуры. Врач-инфекционист тесно сотрудничает, как правило, с дерматовенерологами, офтальмологами, стоматологами.

Для лечения герпетической инфекции врач-инфекционист назначает следующие препараты:

  • Ацикловир
  • Валацикловир
  • Фамцикловир

Одни препараты представлены таблетками и предназначены для системного лечения, другие представлены мазями и кремами и направлены на ускорение выздоровления.

В зависимости от степени и локализации поражения схемы лечения могут отличаться по продолжительности и режиму дозирования препарата.

Для успешного лечения герпеса следует выполнять все рекомендации врача и исправно принимать лекарственные препараты без пропусков.

Меры профилактики герпеса

С целью профилактики герпеса врач может назначить Вам курс противовирусной терапии, если Вы отмечаете более 9 эпизодов рецидива в год.

Следует избегать поцелуев и тесных телесных контактов в стадию волдырей. Вирус распространяется легче всего в случае подсачивания жидкости из пузырьков.

Держите руки в чистоте, если у вас обострение герпетической инфекции.

Избегайте совместного использования предметов личной гигиены в период обострения герпетической инфекции.

Анализ: Определение антител класса G (IgG) к вирусу простого герпеса 2 типа (Herpes simplex virus 2) в крови

Описание

Описание: Герпетическая инфекция (ГИ) — это заболевания, вызываемые вирусами простого герпеса (ВПГ) первого и второго типов, сопровождающиеся поражением кожи и слизистых оболочек, в отдельных случаях — глаз, центральной нервной системы и внутренних органов. Вирус 1 типа в подавляющем большинстве случаев поражает кожу лица, туловища, конечностей, слизистую полости рта, глаз, носа и т.д., вирус 2 типа — половые органы. В настоящее время имеются данные, что ВПГ-1 и ВПГ-2 могут быть агентами одних и тех же заболеваний герпетической этиологии, а также обуславливать патологию беременности и родов, нередко приводя к спонтанным абортам и гибели плода или вызывать генерализованную инфекцию новорожденных. Заболевание передается преимущественно воздушно-капельным путем, а также при половых контактах и при поцелуе от больных ГИ, как с яркой клинической картиной, так и с бессимптомным течением инфекции. Первичное заражение детей происходит обычно внутриутробно или во время родов, если будущая мать является больной ГИ. Факторами, способствующими проявлению герпеса, являются снижение иммунитета больного, переохлаждение или перегрев организма, стрессовые ситуации и т.д. Герпетическая инфекция начинается с небольшого зудящего пятнышка, затем образуются мелкие, содержащие жидкость, пузырьки, которые быстро лопаются и оставляют язвочки. Возможно повышение температуры и болезненность в области лимфатических узлов. Далее ВПГ сохраняется в организме человека в течение всей жизни, находясь в латентном (дремлющем) состоянии и может проявиться через разные промежутки времени. Для диагностики ГИ используется метод иммуноферментного анализа (ИФА): исследование крови на наличие антител к ВПГ 1 и 2 типов (иммуноглобулинов класса М и G). При исследовании сывороток крови в динамике, увеличение титров Ig G говорит о рецидивах ГИ. Реактивацию инфекции можно также диагностировать при определении авидности имеющихся Ig G. Сроки исполнения: До 3 дней. Подготовка к исследованию: Кровь сдается натощак (спустя 4-5 часов после приема пищи).

Вирус Простого Герпеса — диагностика и анализ. ВПГ тип 1 и 2.

Вирус Простого Герпеса — диагностика и анализ. ВПГ тип 1 и 2.

КДЦ МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского » Инфекционные заболевания » Вирус Простого Герпеса — диагностика и анализ. ВПГ тип 1 и 2.
ИсследованиеЦена(первый/повторный)Как сдавать
Лабораторная диагностика герпеса, вызванного ВПГ тип 1 и 2
Выявление специфических антител к Human herpes virus 1,2 типов IgM, IgG (ИФА) 1990-00
ВПГ (Герпес) IgG тип 6 (ИФА) 815-00
ДНК Human herpes virus 1,2 типов (ПЦР) 380-00

 

 

ЭТИОЛОГИЯ.

Впервые ВПГ выделил Гротер (W.Gruter) в 1912 году. Это ДНК-содержащий вирус, вирион которого со­стоит из центрально расположенного плотного нуклеотида, белковой капсулы — капсида и наружной оболочки. Наружняя оболочка неправильной формы содержит белки, углеводы, липиды и другие вещества, а в антигенном отношении прояв­ляет сродство с антигенами клетки хозяина. На своей оболоч­ке ВПГ имеет антирецепторы, благодаря чему он присоединя­ется к тканям экто- и эндодермального происхождения (пан-тропизм). То есть он может поражать кожу, слизистые, центральную и периферическую нервную систему, печень, эн­дотелий сосудов, клетки крови (Т-лимфоциты, эритроциты, тромбоциты). < ВПГ >, как ДНК-содержащий < вирус >, может ин­тегрировать генетический аппарат клетки хозяина и вызывать злокачественную трансформацию клеток (< ВПГ >-2 и рак шейки матки). При этом не обязательно постоянное присутствие вируса в клетке. Геном < ВПГ > может интегрировать с генами не­которых других < вирусов >, вызывая их активацию. С другой стороны развитие ряда < вирусных > и бактериальных инфекций сопровождается активацией латентного < герпеса >.

ВПГ термолабилен, при нагревании до 50-52 °С он инактивируется через 30 минут. Вирус погибает под воздействием ультрафиолетовых и рентгеновских лучей. ВПГ чувствителен к действию этилового спирта, протеолитических ферментов, фосфатазы, желчи и других органических растворителей. Низ­кие температуры вирус переносит хорошо и при температуре от -20 °С до -70 °С сохраняется в жизнеспособном состоянии годами или десятилетиями. Устойчив он также к повторному замораживанию и оттаиванию, действию ультразвука и года­ми может сохраняться в высушенном состоянии.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ.

Источниками инфекции при забо­леваниях вызываемых ВПГ являются больные с различными формами болезни, в том числе и латентной, а также вирусо-носители. Вирус передается главным образом контактным пу­тем (прямой контакт), возможна передача возбудителя также контактно-бытовым, воздушно-капельным и вертикальным пу­тями (от матери к плоду). Последнее может осуществляться во время родов (контакт с родовыми путями матери), трансплацентарно или же вирус проникает в полость матки через цервикальный канал (восходящий путь). В связи с тем, что при генерализации процесса имеет место вирусемия возможен трансфузионный и парентеральный пути передачи.

Восприимчивость всеобщая, антитела к ВПГ выявляются у 80-90% взрослых. Наибольшее количество заболеваний регистрируется в холодные месяцы, но эпидемии не бывает, хотя могут наблюдаться небольшие вспышки в дошкольных учреждениях, школах, больницах.

ПАТОГЕНЕЗ.

Независимо от того, каким путем < ВПГ > по­падает в организм, начальное размножение < вируса > происходит у входных ворот, далее он проникает в региональные лимфо­узлы, затем в кровь и гематогенно заносится во внутренние органы, мозг. В центральную нервную систему он может проникать и по нервным стволам. Первичное заражение, как правило, происходит в раннем детстве и протекает первичный герпес у 80% больных бессимптомно. Уже через несколько дней после заражения в сыворотке крови появляются антите­ла (у 85% детей до 3 лет они уже имеются). Попав в организм, ВПГ сохраняется в нем в течение всей жизни, находясь в не­активном (латентном) состоянии. Вирусоносительство встречается более чем у 90% людей и является одной из особенностей герпеса. Причем вирус может обнаруживаться только после его реактивации в результате ослабления иммунитета под влиянием разнообразных факторов, поскольку вирус находится в клетках паравертебральных сенсорных ганглиев в непродук­тивном состоянии. Дефекты иммунной системы приводят к рецидиву болезни.

Но существует и другая точка зрения, согласно которой репродукция и выделение из ганглия ВПГ происходит посто­янно, но в небольшом количестве. Мигрируя центробежно, он из ганглия по аксону периферического нерва достигает эпите­лиальных клеток, но механизмы защиты устраняют микрооча­ги инфекции, то есть предупреждают клинические проявле­ния. Определенную роль играют и защитные свойства кожи.

Несмотря на то, что причины длительной персистенции < вируса > в организме человека пока до конца не ясны, можно с уверенностью говорить, что иммунные механизмы контро­лируют репродукцию < ВПГ и обеспечивают его сохранение в организме человека в латентном состоянии. Чем более выражен иммунодефицит, тем тяжелее протекает болезнь: с генерализацией процесса, поражением ЦНС, легких, печени и других органов. В пораженных ВПГ тканях обнаруживают характерные гигантские многоядерные клетки с внутриядерны­ми включениями.

КЛИНИКА.

Заболевания вызываемые ВПГ подразделяют на первичную и вторичную (рецидивирующую) герпетичес­кую инфекцию. По клиническим проявлениям выделяют 4 формы: латентную, локализованную, генерализованную и сме­шанную.

Первичная герпетическая инфекция возникает при первом контакте человека с ВПГ. Как правило это происходит в ран­нем детском возрасте (до 5-ти лет).

После короткого (от 2-х до 14-ти дней) инкубационного периода в крови начинают определяться тела к ВПГ и у 80-90% первично инфицированных болезнь протекает в латент­ной форме. У 10-20% имеют место клинические проявления для которых характерен общеинфекционный синдром с ли­хорадкой и другими признаками интоксикации. Чаще всего это ОРЗ или афтозный стоматит. Первичный герпес может проявляться поражением кожи и слизистых, в том числе конъ­юнктивы или роговицы глаза. Особенно тяжело протекает первичная герпетическая инфекция у новорожденных и на фо­не выраженного иммунодефицита. Здесь возможна генерали­зация процесса с поражением внутренних органов и/или го­ловного мозга. Без этиотропной терапии обычно заканчивает­ся смертью.

Вторичная (рецидивирующая) герпетическая инфекция встречается в любом возрасте после первичного герпеса. Так как рецидивы возникают при наличии противовирусных анти­тел, то они протекают со слабовыраженным общеинфекцион­ным синдромом и, как правило, на фоне болезней и/или со­стояний снижающих иммунитет: другие инфекционные и со­матические болезни, переохлаждение, перегрев, ультрафиоле­товое излучение, эндокринные изменения (например менструа­ции), эмоциональный стресс и т. п.

Рецидивы простого герпеса могут возникать с различной частотой. Если они проявляются один раз в несколько лет (но не чаще 2-х раз в год), высыпания выражены в умеренной сте­пени и фиксированы на одном и том же месте, то это являет­ся неплохим прогностическим признаком. Если же рецидивы возникают чаще (1 раз в квартал и чаще), то можно говорить о дефекте в иммунной системе и необходимости ее коррекции.

Клинические проявления первичного и вторичного герпеса имеют много общего и различаются в основном по количест­венным, а не по качественным признакам. При первичном герпесе более выражены симптомы общей интоксикации, тя­желее протекают местные поражения и чаще происходит ге­нерализация процесса.

Локализованные формы простого герпеса (син. пузырько­вый лишай — herpes simplex) дифференцируют прежде всего по локализации очагов поражения (кожа, слизистые, глаза и т.п.).

ПОРАЖЕНИЕ КОЖИ ПРИ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ

Наиболее распространенная форма герпетической инфекции. Клиническая картина характеризуется появлением на коже после инкубационного периода (2-12 дней, чаще 3-4 дня) группы пу­зырьков диаметром 0,1-0,3 см на фоне ограниченного, слегка отеч­ного розового пятна. Часто за 1-2 суток до высыпания больные чувствуют жжение и зуд кожи на месте будущей сыпи. Содержи­мое пузырьков вначале прозрачное, через несколько дней мутнеет. Расположены пузырьки тесно и нередко сливаются в многока­мерный сплошной пузырь. В дальнейшем пузырьки вскрываются, образуя мелкие эрозии. Образующиеся корочки отпадают, эрозии эпителизируются и на 6-8 день заживают, не вызывая рубцовых изменений кожи. Иногда сроки заживления удлиняются до 3-4 недель и более. Высыпание пузырьков сопровождается ощущени­ем зуда, жжения, общего недомогания, боли.

Пузырьковые высыпания имеют фиксированный характер и при первичной инфекции располагаются в месте внедрения вируса, а при вторичной — в зоне иннервации того или иного нерва. Обычная локализация — кожа лица: окружность рта, особенно красная кайма губ (herpes labialis), носа (herpes nasalis), реже кожа щек, век, ушных раковин.

Распространенные герпетические поражения кожи могут возникнуть при массивной инфекции, например у борцов, ког­да при тесном контакте вирус втирается в кожу. Обычная ло­кализация сыпи в этом случае — руки, туловище, лицо. Неред­ко повышается температура (до 38 °С) и имеют место другие симптомы общей интоксикации. Элементы сыпи находятся в разных стадиях развития (везикулы, пустулы, корочки).

 

ГЕРПЕТИФОРНАЯ ЭКЗЕМА (экзема Капоши, вакцино-формный пустулез) развивается на месте экземы, эритродермии, нейродерматита и др. хронических поражений кожи. Чаще все­го эта форма простого герпеса встречается у детей. Обычно по­сле острого начала с повышением температуры до 40 °С, озно­ба, симптомов общей интоксикации на 3-4 день на поражен­ных участках кожи появляются многочисленные, довольно крупные однокамерные пузырьки с прозрачным содержимым (иногда содержимое пузырьков носит геморрагический харак­тер), распространяющиеся постепенно на соседние здоровые участки. Затем образуются корочки, может быть шелушение ко­жи. Температура и другие симптомы общей интоксикации (сла­бость, разбитость, мышечные боли, снижение аппетита и пр.) сохраняются в течение 8-10 дней. Больных беспокоит также зуд, жжение, напряжение кожи, регионарный лимфаденит. У детей до 1 года заболевание протекает особенно тяжело и за­канчивается в 10-40% случаев летальным исходом.

К редко встречающимся (атипичным) проявлениям по­ражений кожи при простом герпесе можно отнести:

1. Зостериформную разновидность простого герпеса. Она характеризуется расположением высыпаний по ходу нервных стволов чаще в области нижних конечностей, ягодиц и лица. От опоясывающего лишая эта форма простого герпеса отлича­ется отсутствием болей, иррадиирующих по ходу нерва.

2. Геморрагическую форму с кровянистым содержанием пузырьков.

3. Геморрагически-некротическую, характеризующую об­разованием некрозов на месте высыпаний.

Язвенно-некротическая форма также относится к атипич­ным и возникает на фоне тяжелого иммунодефицита любого генеза. У больных на фоне типичных высыпаний образуются язвы, которые постепенно увеличиваясь, достигают 2-5 см в диаметре. Позже они сливаются в обширные язвенные по­верхности с неровными краями. Такие поражения сохраняют­ся в течение нескольких месяцев, а обратное развитие проис­ходит медленно (если они сохраняются более 3-х месяцев, то их относят к СПИД-маркерным заболеваниям).

К атипичным формам простого герпеса также относят эритоматозную, папулезную, зудящуюся и отечную. При них везикулы не образуются, а в месте появления рецидива воз­никают соответственно гиперемия, мелкие папулы, резкая| отечность тканей в области поражения. Частые рецидивы этой формы в одном и том же месте могут быть причиной стойко­го элефантиаза (элефантиазоподобный герпес).

Абортивная форма простого герпеса также может быть отнесена к атипичным. Она встречается преимущественно у лиц, часто контактирующих с больными (медицинские работники). Входными воротами для вирусов является кожа пальцев и ладоней. Типичные везикулы при этом отсутствуют. Болезнь сопровождается кожным зудом, чувством жжения и, нередко, болями по ходу нервов. Местные изменения характеризуются отеком и гиперемией кожи. Нередко при этом ставится диагноз «панариций».

ПОРАЖЕНИЕ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК ПРИ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ

Герпетический стоматит может быть проявлением как первичной, так и рецидивирующей герпетической инфекции. Наиболее часто эта форма встречается у детей 1-3 лет. Начинается болезнь остро с повышения температуры и общего недомогания. У детей отмечается плохой аппетит, беспокойство, нарушение сна. Через 1-2 дня на гиперемированных и отечных слизистых оболочках щек, языка, неба, десен, губ возникает множество пузырьков, которые через 2-3 дня лопаются, образуя очень болезненные эрозии, покрытые белым налетом в виде афт. Появляется интенсивное слюноотделение, болез­ненность и увеличение регионарных лимфатических узлов. Выздоровление наступает через 2-3 недели.

У 40% больных после выздоровления возможно развитие хронического рецидивирующего герпетического стоматита. Протекает он, как правило, без лихорадки и интоксикации.

Если имеет место поражение ВПГ слизистых оболочек верхних отделов дыхательных путей, то возникают острые респираторные заболевания, которые клинически не отлича­ются от ОРЗ другой этиологии. Их частота составляет 5-7% всех ОРЗ.

Генитальный герпес чаще всего протекает бессимптомно. ВПГ может персистировать у мужчин в мочеполовом тракте, а у женщин в канале шейки матки, влагалище и уретре. Лица с бессимптомным генитальным герпесом являются источниками и резервуарами инфекции.

Клинические проявления генитального герпеса наиболее ярко наблюдаются при первичном инфицировании. После ин­кубационного периода (около 7 дней) на половых органах возникает отек и гиперемия, затем появляются везикулезные высысыпания на головке и стволе полового члена, на внутренней поверхности крайней плоти, на коже мошонки; у женщин — на больших и малых половых губах, влагалище, промежности. Сыпь, как правило, обильная, пузырьки быстро лопаются, образуя эрозивные или эрозивно-язвенные поверхности. Прак­тически всегда появлению высыпаний предшествует зуд, жже­ние и болезненность слизистых.

Генитальный герпес может сопровождаться лихорадкой, увеличением лимфатаческих узлов, невралгическими болями, возможно образование обширных эрозий и отека половых органов. При орогенитальных и анагенитальных контактах мо­гут возникнуть герпетические тонзилиты, фарингиты, уретриты и проктиты.

50-75% людей после первичного инфицирования герпес принимает рецидивирующее течение. При рецидиве характер болезни будет определяться выраженностью иммунодефицита. При выраженном иммунодефиците рецидивы герпеса сопро­вождаются тяжелыми местными изменениями эрозивно-язвенного характера, распространением процесса на близлежащие участки кожи, регионарным паховым лимфаденитом. Иногда язвы сопровождаются некрозом и на их месте остаются рубцы.

В других случаях в период рецидива изменения отличают­ся от таковых при первичном герпесе отсутствием интоксика­ционного синдрома и менее обильными высыпаниями. У ряда больных могут иметь место абортивные рецидивы, проявляю­щиеся незначительной гиперемией, на фоне которой возника­ют мелкие, быстро вскрывающиеся пузырьки. Нередко все клинические проявления органичиваются только появлением чувства жжения и зуда, а также незначительным отеком и ги­перемией кожи и слизистых половых органов.

Часто рецидивирующий генитальный герпес приводит к вовлечению в патологический процесс лимфатических сосу­дов. При этом у больных возможно развитие лимфостаза, как результат, — слоновость половых органов.

Генитальный герпес представляет собой важную медицин­скую и социальную проблему. Рецидивирующий генитальный герпес нередко препятствует созданию семьи, частые рецидивы нарушают нормальную половую жизнь. Следствием дли­тельно существующего генитального герпеса могут быть неврастенические и депрессивные нарушения. У женщин ге­нитальный герпес даже при бессимптомном течении может стать причиной невынашивания беременности, заражения пло­да и новорожденного, что приводит к умственному недоразви­тию, уродствам или летальному исходу. С возбудителем генитального герпеса связано возникновение рака шейки матки.

Офтальмогерпес может быть первичным и вторичным (рецидивирующим).

Первичный герпес развивается у людей, не имеющих противовирусного иммунитета (дети от 6 месяцев до 5 лет или взрослые в возрасте от 16 до 25 лет). Первичная инфекция у детей вызывается ВПГ-1, после 16 лет — ВПГ-2. Клинически довольно часто (до 40%) отмечается сочетание кератоконъюнктивита с поражением кожи век, лица.

Более 90% герпетических поражений глаз приходится на вторичный (рецидивирующий) офтальмогерпес. Так как реци­дивы возникают на фоне циркулирующих противовирусных антител, то обычно не наблюдается распространения процесса. Чаще всего эта форма офтальмогерпеса встречается у мужчин в возрасте 20-40 лет.

Поверхностные поражения переднего отдела глаза харак­теризуются развитием конъюнктивита (фолликулярного, ка­тарального, везикулезно-язвенного), сочетанного поражения конъюнктивы и век — блефаро-конъюнктивита, каналикулита, различных кератитов (точечный, везикулезный, древовидный, географический, краевой). Возможно развитие рецидивирую­щей эрозии роговицы, а также изолированное поражение склеры в виде диффузного (нередко двухстороннего) эписклерита. При герпетическом конъюнктивите слизистая век, глазного яблока, краев век гиперемирована. Характерны умеренные светобоязнь и слезотечение. Для везикулезного и древовидного кератита характерно развитие умеренно выраженных светобоязни, слезотечения, перикорнеальной инъ­екции, а затем невралгии (часто значительной) по ходу I и II ветвей тройничного нерва.

Глубокие поражения переднего отдела глаза характеризу­ются распространением инфильтрации в строму роговицы и протекают в виде стромального кератита (с изъязвлением и без). Большинство из них сочетаются с воспалением переднего отдела сосудистого тракта, то есть являются кератоиридо-циклитами.

Рецидивирующие герпетические поражения внутренних оболочек глаза проявляются в виде изолированного иридоциклита, хориоидита, периваскулита и флеботромбоза сетчатки, неврита зрительного нерва.

Висцеральные формы простого герпеса проявляются во­влечением в патологический процесс нервной системы, лег­ких, печени и других внутренних органов.

Поражение центральной нервной системы протекает чаще всего в виде серозного менингита и острого энцефалита. По характеру клинических проявлений герпетические менингиты и энцефалиты трудно отличить от аналогичных заболеваний, вызываемых другими возбудителями. По данным литературы герпетическую природу имеют около 10% всех энцефалитов, 0,6% асептических менингитов и 20% менингоэнцефалитов.

Поражение периферической нервной системы протекает по типу невритов и полирадикулоневритов.

Герпетические пневмонии возникают в результате актива­ции герпетической инфекции под влиянием различных имму-нодепрессантов. При этом практически всегда имеет место на­слоение вторичной бактериальной инфекции.

Герпетический гепатит представляет собой одно из прояв­лений генерализованной инфекии. С возможностью изо­лированного поражения печени ВПГ у взрослых согласны не все ученые. Герпетический гепатит характеризуется острым началом, выраженной интоксикацией, коротким преджелтушным периодом, быстрым развитием желтухи и тяжелым тече­нием с развитием острой печеночной энцефалопатии. Исход болезни, как правило, летальный.

Обследование при планировании беременности не ЗППП

Вы планируете беременность, значит, вы должны знать, что вам необходимо пройти обследование перед беременностью на инфекции, которые передаются половым путем. Как же грамотно сдать все анализы, какое именно лечение необходимо, если инфекцию все-таки обнаружат?

В этой статье будут освящены только те инфекции, которые часто становятся предметом споров — как их лучше выявлять, всегда ли их нужно лечить, какое лечение лучше назначать женщине. Очень часто пациенты занимаются самообманом, всецело доверившись результатам единственного анализа. Будут освящены пять инфекций — хламидиоз, микоплазмоз, урепаплазмоз, герпес, цитомегаловирус.

Если у вас обнаружили хламидиоз

Хламидиоз — инфекционное заболевание, которое передается половым путем при незащищенном коитусе. Причиной хламидиоза могут стать бактерии хламидии. Вероятность того, что вы заразитесь ими бытовым путем — посидев на унитазе, поплавав в бассейне — очень низка, так как хламидии быстро погибают вне организма человека.

Симптомы хламидиоза

Инкубационный период составляет от 7 до 30 дней. У женщины: белые, желтые, прозрачные выделения из влагалища, болезненность при мочеиспускании, при половом акте, боли внизу живота, в области поясницы. У мужчины: выделения из уретры — прозрачные, скудные, боль при мочеиспускании и коитусе.

Хламидиоз часто протекает бессимптомно, обнаружить его можно на основании сданных анализов. Хламидийная инфекция может быть причиной осложнения. Для женщин она чревата воспалительными заболеваниями матки и придатков, что может привести к бесплодию. Для мужчин она чревата воспалением придатка яичка — эпидидимит. Для того, чтобы выявить эту инфекцию, нужно сдать анализа на хламидии с помощью метода ПЦР — ДНК-диагностика. Если врач обнаружит хламидии, то назначит курс лечения, который нужно пройти обязательно обоим партнерам.

Лечение хламидиоза: назначается курс антибиотиков длительностью 21 день. Если хламидиоз обнаружен во время беременности, то женщине также назначают антибиотики, которые разрешены во время беременности — курс 2 недели, но это можно делать только после 20 недели беременности.

Чем хламидиоз опасен при беременности

При хламидиозе возрастает риск прерывания беременности. Если заразиться плод, то это приведет к хламидийной пневмонии новорожденного, к тому, что у него возникнут воспалительные заболевания глаз. Лечение хламидийной инфекции во время беременности обязательно!

Если обнаружили уреплазмоз, микоплазмоз

Уреаплазмы — бактерии, обитающие в организме человека, на слизистых половых органов, мочевыводящих путях. Эти микроорганизмы можно отнести к числу условно-патогенных, это означает, что они есть у каждого человека. Если количество бактерий резко растет, то начинает превышать допустимые пределы, у человека возникают болезненные симптомы. Это происходит при ослаблении иммунитета.

Микоплазмоз и уреаплазмоз передаются половым путем. Также еще один из способов передачи — от ребенка к матери, при этом человек может до определенного возрасти даже и не подозревать о том, что это заболевание — причина ослабления иммунитета. Симптомы уреплазмоза: воспалительные заболевания матки и придатков, цистит, пиелонефрит, камни в почках, бактериальный вагиноз. У мужчин эти бактерии чаще всего быстро размножаются при уретрите, пиелонефрите, камнях в почках.

Диагностика уреплазмоза

Для того, чтобы выявить уреплазмоз нужно сдать анализы, используя ПЦР или культуральный посев.
Культуральный метод показывает более объективную картину — количество бактерий. ПЦР дает информацию о том, что эти микроорганизмы находятся в мочеполовых путях, однако их количество не устанавливает. Если у женщины обнаружат микоплазмы или уреаплазмы в количестве 102, то не нужно лечение, если же в количестве 104, то лечить нужно. С помощью культурального посева также можно установить, какой антибиотик пригодится для того, чтобы лечение оказалось эффективнее. При выявлении уреаплазм и микоплазм по анализу крови часто бывают ложноположительные результаты.

Лечение уреаплазмоза. Лечат обычно тогда, когда у женщины есть проблемы со здоровьем — воспаление матки, придатков, цистит, пиелонефрит. Если женщины не испытывает боли, то пролечить эти инфекции не нужно. Немотивированное употребление антибиотиков приведет лишь к нарушению микрофлоры влагалища.

Если же мы говорим о планировании беременности, то лечить нужно обязательно, даже если у женщины нет симптомов заболевания. Лечение заключается в приеме антибиотиков-курс 10 дней. Для того, чтобы начать прием, нужно сделать посев на чувствительность к антибиотикам, чтобы определиться с выбором нужного препарата. Курс должны пройти и муж, и жена.

Если же уреаплазма обнаруживается во время беременности, то женщине также назначается антибиотик. Лечение проводится только после 20 недели беременности. До этого женщине назначают терапию иммуноглобулином (с 10 недели беременности).

Чем опасна уреаплазма и микоплазма

Уреаплазма и микоплазма могут привести к прерыванию беременности или же преждевременным родам, также ребенок может быть инфицирован. Также у детей могут развиться патологии мочевыводящих путей, циститы, пиелиты.

Если обнаружили герпес генитальный

Вирус простого герпеса опасен для вашего еще не родившегося ребенка. Генитальный ребенок передается половым путем, может быть передан матерью ребенку. Человек живет и не знает о том, что в нем живет инфекция, а при ослаблении иммунитета герпес вдруг проявляется.

Симптомы генитального герпеса — при заражении герпесом появляется боль, жжение, отечность в области половых органов. Эти симптомы сопровождаются общим недомоганием, подъемом температуры, головной болью. На половых органах появляются маленькие пузырьки, которые наполнены жидкостью. Пузырьки лопаются и образуются болезненные красные язвочки. Заживают в течение двух недель.
Если случается рецидив заболевания, то он сопровождается подъемом температуры, к рецидивам может привести переохлаждение, стресс. Генитальный герпес протекает бессимптомно, возможно заражение мужа женой или наоборот.

Диагностика генитального герпеса: если вы планируете беременность, то вам нужно сдать анализ крови из вены на антитела класса IgM и IgG к вирусы простого герпеса.

Если согласно результатам анализа выявят антитела класса G – организм уже сталкивался с генитальным герпесом. Если же присутствуют антитела к иммуноглобулинам класса М — генитальный герпес находится в острой стадии.

Лечение генитального герпеса: лечиться нужно противовирусными препаратами, партнер также должен сдать анализ — он может быть не инфицирован. Во время беременности противовирусные препараты принимать нельзя, но обязательно проходить терапию иммуноглобулинами.

Чем опасен генитальный герпес при беременности

Первичное заболевание герпесом во время беременности самое опасное. Оно ведет к прерыванию беременности, а также к серьезным поражениям плода. Если беременная заражается этим вирусом незадолго до предполагаемого появления ребенка на свет, то врач отказывает в естественных родах, женщине делают кесарево сечение. При естественных родах же велик риск заражения ребенка при прохождении через родовые пути матери. Если заболевание находится в острой фазе, то ребенок с высокой вероятностью может заразиться, поэтому нужно пролечить своевременно.

Если обнаружили цитомегаловирус

Цитомегаловирус передается половым путем, также может быть передан от матери к плоду, возможна передача вируса через поцелуи, через кровь.

Цитомегаловирус протекает бессимптомно, через месяц-два мононуклеозоподобный синдром. Он похож на ОРВИ и грипп, сопровождается высокой температурой, ознобом, человек сильно утомляется, испытывает недомогание, у него болит голова.

Если же иммунитет ослаблен, то цитомегаловирус может стать причиной тяжелых заболеваний — поражения глаз, легких, пищеварительной системы и головного мозга.

Диагностика цитомегаловируса: он может быть выявлен по результатам анализа крови из вены на антитела класса IgM и IgG к цитомегаловирусу. Если фиксируются антитела к иммуноглобулинам класса М, то болезнь в острой стадии, если обнаружены антитела к иммуноглобулинам класса G, то организм уже встречался с данной инфекцией.

Лечение цитомегаловируса: женщине назначаются иммунные препараты, во время беременности проводится иммунотерапия с использованием разрешенных к применению препаратов.

Чем опасен цитомегаловирус во время беременности: опасно первичное заражение цитомегаловирусом во время беременности, оно может привести к инфицированию плода, к прерыванию беременности, к порокам развития плода. Лечение цитомегаловируса до беременности и во время беременности обязательно.

Как правильно сдавать анализа на выявление заболеваний, передающихся половым путем

Делайте это перед менструацией, сразу после нее. В такие дни иммунитет женщины снижается. За 20 дней до сдачи анализов нужно прекратить прием антибиотиков, перестать ставить свечи и т. д. Перед посещением врача не нужно подмываться, принимать душ.

Когда сдаются анализы?

В первый раз — до наступления беременности. Если обнаружат инфекцию, то нужно пройти лечение, затем повторно сдать анализы. В течение 3 недель половую жизнь нужно вести с презервативами. Одни из партнеров может не вылечиться.
После наступления беременности, вы встанете на учет к акушеру-гинекологу, врач еще раз предложит сдать анализы. Новые всплески возможны в период беременности, так как иммунитет женщины сильно ослабляется.
Если врач назначит несколько курсов антибиотиков подряд, чтобы пролечить одну и ту же инфекцию, то стоит задуматься — продолжать ли лечение у него, стоит поискать другую клинику.

Врач-акушер-гинеколог                            Куриленко Елена Георгиевна

VPg мышиного норовируса связывает факторы инициации трансляции в инфицированных клетках | Virology Journal

Рекомбинантный VPg MNV-1 связывает рибосомный белок eIF3, eIF4GI, eIF4E и S6 in vitro

VPg NV геногруппы I и SMV геногруппы II имеют 68% идентичности аминокислотной последовательности и оба связывают очищенный eIF3 и eIF3 в клетке. выдержки [5]. Последовательности VPg MNV-1 и NV были выровнены и имели 54% идентичности (рис. 1). N- и C-концевые домены показали наивысший уровень консервативности и фланкировали центральную вариабельную область, которая включает богатую глицином вставку из девяти аминокислот в NV VPg.Интерпретация в контексте предполагаемой функции VPg в трансляции, общей идентичности аминокислотной последовательности 54% и консервативности как в N-, так и в C-концевых доменах, позволяет предположить, что MNV-1 может иметь сходные свойства связывания eIF с NV VPg.

Рисунок 1

MNV-1 VPg и NV VPg имеют значительную идентичность аминокислотной последовательности . Последовательности, кодирующие MNV-1 VPg и NV VPg, были выровнены с ClustalW. Звездочки обозначают идентичные остатки. Точка с запятой — это консервативная замена.Аминокислотные номера соответствуют положению в полипротеине ORF1.

Чтобы проверить, связывает ли MNV-1 VPg eIFs в бесклеточной системе, VPg был выражен как слитый белок GST в очищенных бактериях (рис. 2A) и использован в анализах методом «выпадающего списка» с экстрактами, приготовленными из макрофагов RAW 264.7 в виде описано ранее [5]. Белки в нисходящих элюатах анализировали с помощью иммуноблотов с антителами к eIF3 (рис. 2B), фосфо-eIF4GI (рис. 2C), eIF4E (рис. 2D) и рибосомному белку S6 (рис. 2E).Подобно данным, полученным для NV VPg, все эти факторы связывают MNV-1 GST-VPg.

Рисунок 2

MNV-1 GST-VPg связывает eIF3, фосфо-eIF4GI, eIF4E и рибосомный белок S6 с помощью анализа методом pull-down . GST и MNV-1 GST-VPg были экспрессированы в бактериях и очищены, как описано в тексте. А) Очищенный GST и GST-VPg, анализированный 10% SDS-PAGE и окрашенный кумасси синим. Белки в нисходящих элюатах подвергали SDS-PAGE, а затем проводили иммуноблоттинг с помощью (B) анти-eIF3, (C) анти-фосфо-eIF4GI, (D) анти-eIF4E и (E) рибосомного анти-S6. белок.Блоты проявляли с хемилюминесцентным субстратом ECL. Звездочка в B указывает на белок, идентифицированный как eIF4GI.

eIF3 — большой комплекс, состоящий из 12 субъединиц [7]. Четыре из этих субъединиц, eIF3a, дублет eIF3b / eIF3c [14] и eIF3d, были идентифицированы в элюатах VPg pull-down. Идентификация была сделана по образцу полос, который наблюдается для eIF3, когда это поликлональное антитело используется в качестве зонда [14]. Причины обнаружения только нескольких субъединиц в элюатах неизвестны, но этот большой комплекс может быть нестабильным в условиях анализа.Сыворотка против eIF3 содержит антитела к eIF4GI [14]. Следовательно, высокомолекулярный белок, обнаруженный в иммуноблотах, исследованных с помощью этой сыворотки, вероятно, представляет собой eIF4GI. Присутствие этого фактора в реакциях «вытягивания» было подтверждено зондированием блотов антителом против фосфо-eIF4GI (рис. 2С). Продукты с более низкой молекулярной массой, которые реагировали с антителом фосфо-eIF4GI, интерпретируются как продукты распада полноразмерного белка. Взятые вместе, данные выпадающих анализов и предыдущие результаты показывают, что взаимодействия между NV VPg и eIF и между MNV-1 VPg и eIF одинаковы.

Совместное преципитация

VPg и eIF из клеток RAW 264.7, инфицированных MNV-1

Для исследования взаимодействий между VPg и eIF в инфицированных клетках, клетки RAW 264.7 были инфицированы MNV-1, и иммунопреципитация (IP) была выполнена в соответствии с установленными протоколами [13 , 15]. VPg MNV-1 присутствовал в лизате инфицированных, но не ложно инфицированных клеток (фиг. 3A, полоса 2, средняя панель) и антителах к VPg, иммунопреципитированным VPg (фиг. 3A, полоса 4, средняя панель) и фосфо-eIF4GI (фиг. 3A, полоса 4). , верхняя панель).Полярная природа VPg приводит к несколько диффузной миграции в полиакриламидных гелях SDS вместо резкой полосы (Daughenbaugh и Hardy, неопубликованные наблюдения). В обратном эксперименте антитело против фосфо-eIF4GI осаждали фосфо-eIF4GI (рис. 3A, дорожки 5 и 6, верхняя панель) и MNV-1 VPg (рис. 3A, дорожка 6, средняя панель). Это демонстрирует, что MNV-1 VPg связывает eIF4GI в инфицированных вирусом клетках.

Рисунок 3

Коиммунопреципитат фосфо-eIF4GI и eIF4E с VPg из RAW 264, инфицированного MNV-1.7 ячеек . A) Лизаты ложно инфицированных или инфицированных клеток подвергали иммунопреципитации с использованием VPg против MNV-1 (дорожки 3 и 4) или антифосфо-eIF4GI (дорожки 5 и 6). Иммуноблоты зондировали соответствующими антителами, указанными слева от панелей. Дорожки 1 и 2 представляют собой контрольные лизаты, которые не получали антитела. B) Имитация лизатов инфицированных или инфицированных клеток, зондированных анти-eIF4GI.

Из этих экспериментов можно сделать три дополнительных наблюдения о eIF4GI. Во-первых, наблюдалось воспроизводимое увеличение количества фосфо-eIF4GI в инфицированных клетках по сравнению с ложно инфицированными клетками (рис. 3A, дорожки 1, 2, 5 и 6, верхние панели).Однако уровни общего eIF4GI, независимо от его статуса фосфорилирования, были сходными в имитационных и инфицированных лизатах клеток (фиг. 3B), что позволяет предположить, что различия в количестве фосфо-eIF4GI не могут быть связаны с повышенной экспрессией eIF4GI. Сообщалось, что количество eIF4GI, фосфорилированного по серинам 1108, 1148 и 1192, увеличивается в ответ на стимуляцию сывороткой, и фосфорилирование в этих сайтах модулируется N-концевой третью белка [16]. Были предложены возможные механизмы, включая дерепрессию eIF4GI за счет прямого фосфорилирования N-конца или, альтернативно, взаимодействия с партнером по связыванию eIF4GI, чтобы подвергнуть С-концевой домен киназной активности [16].Вполне возможно, что инфекция MNV-1 может привести к активации киназ, которые модулируют активность eIF4GI. Альтернативная и не исключающая друг друга возможность состоит в том, что прямые взаимодействия между eIF4GI и VPg изменяют конформацию eIF4GI в форму, в которой С-концевые остатки серина фосфорилируются.

Второе наблюдение заключается в том, что несколько продуктов деградации eIF4GI были обнаружены в клеточном лизате (рис. 3A, дорожки 1 и 2, верхняя панель) или когда белок был иммунопреципитирован антителом против фосфо-eIF4GI (рис. 3A, дорожки 5 и 6, верхняя панель).Напротив, антитело против VPg осаждает исключительно полноразмерный eIF4GI. Если взаимодействие между VPg и eIF4GI является прямым, эти данные предполагают, что сайт связывания для VPg может находиться в N-концевых двух третях eIF4GI, поскольку антитело фосфо-eIF4GI распознает C-концевую треть белка. Если взаимодействие между VPg и eIF4GI является непрямым, полноразмерный eIF4GI мог быть снижен за счет потенциального прямого взаимодействия между VPg и eIF4E, потому что сайт связывания eIF4E находится на N-конце eIF4GI [17].

Наконец, наличие идентичных продуктов деградации как в имитационных, так и в инфицированных клеточных лизатах предполагает, что, в отличие от инфекций FCV [18], eIF4GI не расщепляется детектируемым образом во время инфицирования MNV-1. Хотя мы не проводили обширного анализа расщепления eIF4GI, эти данные согласуются с сообщениями о том, что рекомбинантная протеаза 3C норовируса (штамм MD-145) не расщепляет eIF4GI in vitro [19]. Такой паттерн деградации не наблюдался при зондировании лизатов ложных и инфицированных клеток антителом к ​​общему eIF4GI (фиг. 3B).Причина этого несоответствия не совсем ясна, но мы наблюдали некоторую вариабельность стабильности eIF4GI в лизатах клеток RAW 264.7. Продукты деградации также могут быть С-концевыми фрагментами белка, не распознаваемыми антителом eIF4GI, созданными против N-концевого пептида, который использовали для обнаружения полноразмерного белка.

Goodfellow и соавторы недавно сообщили, что FCV VPg со-преципитирует eIF4E из инфицированных клеток, и что это взаимодействие необходимо для трансляции FCV VPg-связанной РНК in vitro [6].Чтобы определить, был ли VPg MNV-1 связан с eIF4E в инфицированных клетках, мы иммунопреципитировали VPg из лизатов инфицированных клеток и зондировали образцы с помощью иммуноблоттинга на eIF4E. eIF4E был обнаружен в аналогичных количествах в лизатах имитирующих и инфицированных клеток в отсутствие антител (рис. 3A, дорожки 1 и 2, нижняя панель) и осаждается совместно с VPg из инфицированных клеток (рис. 3A, дорожки 3 и 4, нижняя панель). ). Эти данные показывают, что MNV-1 VPg и eIF4E взаимодействуют в инфицированных клетках. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, является ли это взаимодействие с VPg MNV-1 прямым или eIF4E обнаруживается в результате взаимодействий с другими компонентами eIF4F.

Норовирусы разрушают компонент ядра стрессовой гранулы G3BP1, способствуя вирусной VPg-зависимой трансляции

В этом исследовании мы использовали комбинацию биохимических и генетических подходов для идентификации факторов хозяина, участвующих в жизненном цикле норовируса. Наши комбинированные подходы привели к идентификации компонента ядра стрессовой гранулы G3BP1 в качестве белка-хозяина, критически важного для репликации как мышиных, так и человеческих норовирусов в культуре клеток. Кроме того, мы определили, что G3BP1 играет ключевую роль в процессах норовирусного VPg-зависимого синтеза белка, открывая новую функцию G3BP1 в облегчении трансляции генома РНК-вируса.

Ортогональные подходы, использованные в настоящем исследовании, обеспечивают беспрецедентное понимание идентичности факторов хозяина с потенциальной ролью в жизненном цикле норовируса. Подробный протеомный анализ комплексов репликации и трансляции вируса, сформированных во время инфекции MNV (рис. 2), привел к идентификации нескольких факторов хозяина с ранее идентифицированными ролями в жизненном цикле MNV. Мы сосредоточили наши усилия на G3BP1, поскольку он был обнаружен во всех трех подходах, а также был обнаружен на экране CRISPR, опубликованном в ходе этого исследования (Orchard et al., 2016). Кроме того, ранее мы показали, что калицивирус кошек (FCV), родственник норовирусов из рода Vesivirus , расщепляет G3BP1, подавляя образование стрессовых гранул (Humoud et al., 2016). Напротив, инфекция MNV не приводит к расщеплению G3BP1, а вместо этого формирует цитоплазматические очаги, состав которых отличается от канонических стрессовых гранул (Brocard et al., 2018).

G3BP1 является одним из членов группы белков G3BP (связывающих белки, активирующие Ras-GTPase (домен Sh4)), у насекомых называемых Распутин, которые обладают активностью связывания РНК и выполняют множество клеточных функций, включая регуляцию стабильности РНК. и перевод в ответ на стресс.Первоначально идентифицированный как белок, который взаимодействует с белком, активирующим Ras-GTPase (RasGAP), более двух десятилетий исследований значительно расширили наши знания о многофункциональной роли в клеточных процессах. В настоящее время хорошо известно, что G3BP играют роль в выживании раковых клеток, метастазировании и инвазии рака, процессинге специфических miRNA и формировании стрессовых гранул (Reviewed in Alam and Kennedy, 2019). Стресс-гранулы представляют собой динамические цитоплазматические рибонуклеопротеидные комплексы, которые быстро образуются в условиях стресса и в которых клеточные РНК хранятся в застопорившихся трансляционных комплексах (Protter and Parker, 2016).В контексте вирусной инфекции многочисленные исследования показали, что многие, если не все вирусы должны каким-либо образом взаимодействовать со стрессовыми гранулами, поскольку появляется все больше доказательств того, что образование цитоплазматических стрессовых гранул является частью механизма противовирусной защиты (Reviewed в McCormick and Khaperskyy, 2017). Некоторые вирусы взаимодействуют со стрессовыми гранулами, способствуя репликации вируса (Cristea et al., 2010; Kim et al., 2016; Panas et al., 2014; Panas et al., 2012), тогда как некоторые делают это, чтобы противодействовать ингибирующему эффекту стресса. гранулы на трансляцию вирусной РНК (Panas et al., 2015; White et al., 2007).

Наши данные показывают, что G3BP1 играет ключевую роль в продвижении трансляции вирусной РНК, связанной с VPg норовируса. Вирусы с положительной смысловой РНК разработали механизмы, обеспечивающие эффективную трансляцию своих вирусных геномных РНК в присутствии высоких концентраций конкурирующих клеточных РНК. Эти механизмы включают использование внутренних элементов сайта входа в рибосомы (IRES), модифицированные кэп-зависимые механизмы (Firth and Brierley, 2012; Jaafar and Kieft, 2019) и способность нацеливаться на механизм трансляции клетки-хозяина для создания среды, в которой вирусная РНК трансляция предпочтительнее, чем РНК с кэпом клетки (Walsh et al., 2013). Считается, что G3BP1 ассоциируется в первую очередь со свободными субъединицами 40S (Kedersha et al., 2016). Наши данные подтверждают гипотезу, согласно которой ассоциация G3BP1 с 40S рибосомными субъединицами каким-то образом стабилизирует рекрутирование комплекса инициации трансляции на 5′-конец генома вирусной РНК, связанной с VPg, способствуя VPg-зависимой трансляции и тем самым открывая новую функцию в вирусе. конкретный перевод. Механизм, с помощью которого G3BP1 вносит вклад в этот процесс, еще предстоит полностью изучить, но наши данные подтверждают гипотезу, что G3BP1 прямо или косвенно способствует привлечению рибосомных субъединиц к комплексам трансляции, управляемым VPg.RGG-мотив G3BP1, как известно, важен для ассоциации между G3BP1 и 40S субъединицами, а также для способности исходить от стрессовых гранул, тогда как данные предполагают, что RRM может играть регулирующую роль (Kedersha et al., 2016). Эти домены также необходимы для функции G3BP1 в жизненном цикле норовируса (фиг. 6), что подтверждает, что ассоциация G3BP1 с 40S важна для его роли в стимулировании VPg-зависимой трансляции норовируса. Важно отметить, что известно, что домены RGG выполняют множество функций (Thandapani et al., 2013) и, следовательно, в контексте функции G3BP1 в жизненном цикле норовируса, может также вносить вклад в неизвестные взаимодействия, которые способствуют трансляции норовируса. Предыдущая работа с альфавирусами показала, что G3BP1 изолируется путем связывания с белком nsP3 (Panas et al., 2012; Panas et al., 2014; Panas et al., 2015). Более того, это взаимодействие происходит через мотив FGDF, также обнаруживаемый в других вирусных белках, включая белок ICP8 вируса простого герпеса (Panas et al., 2015). Хотя белок VPg MNV имеет аналогичный мотив FGDGF (рис. 1A), этот мотив не консервативен в белке VPg вируса GI Norwalk.Таким образом, наши данные предполагают, что взаимодействие VPg с G3BP1 не является прямым, что согласуется с нашим наблюдением, что это взаимодействие снижается мутациями в связывающем домене eIF4G (Рисунок 1A и Рисунок 9B). В то время как наши данные соответствуют основной роли G3BP1. при трансляции норовируса мы не можем исключить возможность того, что G3BP1 играет другие роли в жизненном цикле вируса. Недавние исследования подтвердили, что G3BP1 обогащен в сайтах синтеза вирусной РНК (Brocard et al., 2018; Fritzlar et al., 2019), поэтому возможно, что G3BP1 напрямую устанавливает множественные контакты между субъединицей 40S и геномом вирусной РНК. Эти дополнительные контакты могут дополнительно способствовать вирусной VPg-зависимой трансляции и / или другому аспекту жизненного цикла вируса.

Технические проблемы, связанные с изучением репликации норовируса человека в культуре клеток, ограничили экспериментальные подходы, которые мы могли бы использовать для проверки роли G3BP1 в трансляции норовируса человека. Однако наши результаты ясно продемонстрировали, что в отсутствие G3BP1 человеческий вирус Norwalk не может реплицироваться или образовывать репликонсодержащие колонии.Кроме того, мы смогли показать, что мышиные микроглиальные клетки BV2 поддерживают репликацию репликона HuNoV GI, хотя и в меньшей степени, чем клетки BHK или U20S (рис. 5). Эти данные подтверждают, что все механизмы, необходимые для репликации HuNoV, сохраняются между клетками человека, хомяка и мыши. Кроме того, восстановление микроглиальных клеток ΔG3BP1 BV2 с помощью WT G3BP1, по крайней мере, частично восстановило способность репликона HuNoV GI образовывать колонии, подтверждая специфичность эффекта.Присутствие G3BP1 в комплексах, содержащих NV VPg, снова согласуется с нашей гипотезой о том, что G3BP1 играет роль в стимулировании вирусного VPg-зависимого синтеза белка.

Ранее мы обнаружили, что норовирусная инфекция приводит к преимущественной вирусной трансляции, в результате чего клеточные мРНК, индуцированные в ответ на норовирусную инфекцию, транслируются неэффективно (Emmott et al., 2017). Эта модификация трансляции клетки-хозяина по крайней мере частично обусловлена ​​способностью вирусной протеазы NS6 расщеплять PABP и индукцией апоптоза, который приводит к расщеплению факторов инициации клеточной трансляции (Emmott et al., 2017). Важно отметить, что хотя расщепленные каспазой факторы инициации трансляции не поддерживают трансляцию, зависящую от кэп-клетки, мы ранее обнаружили, что расщепленные формы eIF4G действительно поддерживают VPg-зависимую трансляцию норовируса (Emmott et al., 2017). Способность протеазы норовируса расщеплять РАВР и другие субстраты также контролируется процессингом полипротеина и взаимодействием с другими вирусными белками (Emmott et al., 2019). Недавняя работа подтверждает, что предпочтительная вирусная трансляция не управляется GCN2-опосредованным фосфорилированием eIF2α в клетках, инфицированных MNV (Brocard et al., 2018). Однако мы отмечаем, что другие предположили, что NS3 может способствовать отключению трансляции, наблюдаемому в инфицированных MNV клетках (Fritzlar et al., 2019), с оговоркой, что это наблюдение было сделано вне контекста инфицированных клеток и использовалось сверхэкспрессируемое вирусное белки. Мы подозреваем, что норовирусы используют несколько механизмов, которые работают совместно, чтобы обеспечить контроль экспрессии генов хозяина и последующую трансляцию клеточных мРНК. Относительный вклад этих процессов в любой данный тип клеток также может варьироваться в зависимости от степени, в которой клетки могут ощущать вирусную инфекцию и отвечать на нее посредством индукции врожденных и апоптотических ответов.

Наблюдение за тем, что многие факторы, обогащенные с использованием белка VPg, были обогащены только комплексами, очищенными с помощью инфекционных MNV, меченных NS1 / 2, может предполагать, что вирусные белки, присутствующие в комплексе вирусной трансляции, отличаются от белков, присутствующих в комплексах, активных для вирусной РНК. синтез. Однако мы не можем формально исключить другие возможные объяснения, включая возможность того, что специфическое обогащение факторов трансляции на NS1 / 2 происходит потому, что NS1 / 2 является первым белком, транслируемым с ORF1, поэтому необработанный NS1 / 2 на N-конце активно транслируемый полипротеин ORF1 может действовать как якорь, способствуя обогащению рибосом и связанных с ними факторов.Кроме того, мы ранее видели, что предшественники, содержащие VPg, могут хуже связывать фактор инициации трансляции eIF4G (Leen et al., 2016), что может препятствовать связыванию некоторых предшественников, содержащих VPg (NS5), с комплексами инициации трансляции. Кроме того, комплекс репликации норовируса содержит ряд высококонсервативных взаимодействий вирусный белок-вирусный белок (Emmott et al., 2019). В рамках этой сети взаимодействий белок NS1 / 2 взаимодействует с вирусной РНК-полимеразой NS7, которая, в свою очередь, связывает VPg.Следовательно, возможно, что взаимодействия, наблюдаемые между белками NS1 / 2 и белками-хозяевами, участвующими в трансляции, происходят через образование комплекса NS1 / 2-NS7-VPg. Как вирусные белок-белковые взаимодействия в репликационном комплексе интегрируются с сетью клеточных белков, идентифицированных в текущем исследовании, и как это облегчает репликацию вируса и / или регулирует ответ хозяина на инфекцию, еще предстоит определить.

Это исследование дает беспрецедентное представление о факторах хозяина, которые, вероятно, участвуют в жизненном цикле норовируса.Как подробно описано выше, мы сосредоточили наш подробный анализ на роли G3BP1, учитывая, что он был идентифицирован на всех трех экранах, однако вполне вероятно, что многие факторы хозяина, идентифицированные на каждом экране, играют ключевую роль в жизненном цикле норовируса. Высокое обогащение белков, участвующих в опосредованном везикулами транспорте, организации органелл и экзоцитозе, хорошо согласуется с нашим текущим пониманием природы комплекса репликации норовируса и его влияния на процессы в клетке-хозяине. Подробный анализ влияния экспрессии неструктурного белка норовируса и инфекции MNV на архитектуру мембраны клетки-хозяина предполагает, что репликационные комплексы норовируса генерируются из эндоплазматического ретикулума (ER) и приводят к образованию одинарных мембранных везикул (SMV), двойной мембраны. везикулы (DMV) и многомембранные везикулы (MMV) (Doerflinger et al., 2017). Процесс, посредством которого неструктурные белки индуцируют образование этих структур, неизвестен, но белки NS1 / 2 и NS4 считаются ключевыми в этом процессе. Ранее мы сообщали, что белок NS1 / 2 из MNV и HuNoV взаимодействует с белками VapA и VapB и что это взаимодействие необходимо для эффективной репликации вируса (McCune et al., 2017). Белок NS4 норовируса связывается с липидными каплями и способен управлять образованием SMV и DMV (Doerflinger et al., 2017), предполагая, что он может регулировать биосинтетические пути, участвующие в синтезе липидов или пути внутриклеточного везикулярного транспорта. Наша характеристика репликационного комплекса указывает на тесную связь с многочисленными белками, участвующими в транспорте везикул и липидном метаболизме (Рисунок 2 — приложение к рисунку 1). Учитывая, что NS1 / 2 и NS4 взаимодействуют с образованием комплекса (Emmott et al., 2019), вполне вероятно, что они работают вместе, чтобы управлять образованием мембраносвязанного репликационного комплекса, регулируя функции нескольких компонентов, характеристика которых потребует дальнейшего анализа.

В заключение, наши данные значительно дополняют растущий объем литературы о роли белков G3BP в жизненном цикле вирусов и расширяют функциональные роли G3BP1, включая содействие процессам вирусной трансляции. Мы идентифицируем G3BP1 как белок-хозяин, который играет важную роль в жизненном цикле норовирусов мыши и человека, идентифицируя первый клеточный провирусный белок с пан-норовирусной активностью. Более того, учитывая очевидную важность G3BP1 на ранней стадии жизненного цикла норовируса, эта работа предполагает, что нацеливание на G3BP1 может иметь терапевтический потенциал в будущем.

Гранты

CBW был поддержан NIH K08 AI128043 и Фондом Burroughs Wellcome Fund. MAM поддерживался NIH U19 AI109725. IG — старший научный сотрудник Wellcome. Эта работа была поддержана фондом Wellcome Trust (Refs: 207498 / Z / 17 / Z и 104914 / Z / 14 / Z) и Исследовательским советом Великобритании по биотехнологиям и биологическим наукам (Refs: BB / N001176 / 1 и BB / 000943N / 1). JBE получил стипендию Черчилля.

Анализ активности тирозил-РНК-фосфодиэстеразы

Abstract

Используя полиовирус, прототипный член Picornaviridae , мы дополнительно охарактеризовали ферментативную активность клетки-хозяина, обнаруженную в неинфицированных клетках, названную «унлинказой», которая распознает и расщепляет уникальную фосфодиэфирную связь 5′-тирозил-РНК, обнаруженную в 5′-конец РНК вириона пикорнавируса.Эта связь связывает VPg, белковый праймер, кодируемый вирусами, необходимый для репликации РНК, с вирусной РНК; он отщепляется от РНК вириона до того, как участвует в синтезе белка в виде мРНК. Из-за удержания VPg на формирующихся цепях РНК и матрицах репликации, но не на вирусных мРНК, мы предполагаем, что пикорнавирусы используют активность унлинказы как средство контроля соотношения вирусных РНК, которые транслируются, по сравнению с теми, которые либо служат матрицами репликации РНК, либо инкапсидированы. . Чтобы проверить нашу гипотезу и дополнительно охарактеризовать этот фермент, мы разработали новый метод определения активности унлинказы.Мы демонстрируем, что с помощью этого анализа можно определить активность унлинказы, что эта уникальная активность остается неизменной в течение полиовирусной инфекции в клетках HeLa и что на активность унлинказы не влияет присутствие экзогенных VPg или анти-VPg антител. Кроме того, мы определили, что унлинказа распознает и расщепляет химерный субстрат человеческого риновируса-полиовируса с той же эффективностью, что и субстрат полиовируса.

Образец цитирования: Rozovics JM, Virgen-Slane R, Semler BL (2011) Сконструированные субстраты VPg-РНК пикорнавируса: анализ активности фосфодиэстеразы тирозил-РНК.PLoS ONE 6 (3): e16559. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016559

Редактор: Дин Лю, Технологический университет Наньян, Сингапур

Поступила: 21 сентября 2010 г .; Принята к печати: 3 января 2011 г .; Опубликовано: 7 марта 2011 г.

Авторские права: © 2011 Rozovics et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана исследовательскими фондами, предоставленными Американским фондом астмы, http://www.americanasthmafoundation.org/. Дополнительного внешнего финансирования для этого исследования получено не было. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Наличие ковалентных связей белок-нуклеиновая кислота не является необычным для вирусных патогенов.Несколько семейств вирусов имеют белок, ковалентно связанный с их геномами; некоторые примеры включают Potyviridae , Adenoviridae, Nepoviridae, и Picornaviridae [см. обзор [1], [2]]. В случае пикорнавирусов этот вирусный белок, называемый VPg (вирусный белок, связанный с геномом), расположен на 5′-конце всех геномов возникающих пикорнавирусов в результате того, что он служит праймером для синтеза РНК [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11].

Появление ковалентных связей белок-нуклеиновая кислота в неинфицированных клетках несколько новее.Эти связи являются результатом неспособности топоизомеразы должным образом диссоциировать от целевой ДНК [см. Обзор [12]]. В таких случаях требуются дополнительные ферменты, называемые фосфодиэстеразами тирозил-ДНК, для разрыва фосфодиэфирной связи, образованной с нуклеиновой кислотой. В настоящее время существует два задокументированных примера этих ферментов в эукариотических клетках: тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 и тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 2 (ранее TTRAP), которые в первую очередь распознают и расщепляют 3 ‘и 5’ фосфодиэфирные связи тирозил-ДНК соответственно [13]. , [14], [15], [16].Интересно, что есть доказательства активности тирозил-РНК фосфодиэстеразы в эукариотических клетках. Существование этого фермента демонстрируется эффективным удалением пикорнавирусного белка VPg, который присоединен к геномной РНК через связь O 4 — (5′-уридилил) тирозин, с 5′-конца вирусного генома (рис. 1) [17], [18]. Хотя этой активности в литературе дано несколько названий, в том числе расщепляющий фермент [18], VPg-унлинказа [19] и уридилилполинуклеотид- (5’P-> O) -тирозинфосфодиэстераза (Y-pUpN PDE) [20], в В этой рукописи мы будем называть ферментативную активность «унлинказой».”

Рисунок 1. Ковалентная связь VPg-РНК и последовательности VPg полиовирусов дикого типа и мутировавших W1-VPg31.

Схема ковалентной связи VPg-РНК между одиночным остатком тирозина в VPg полиовируса и первым уридином на 5′-конце геномной РНК (A). Изображение было создано с помощью программного обеспечения ChemDraw. Стрелка указывает, где унлинказа разрывает связь. (B) Последовательности VPg полиовируса дикого типа и W1-VPg31 (полиовирус дикого типа, мутировавший для кодирования двух метионинов в кодирующей области VPg).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016559.g001

Идентификация унлинказы неизвестна, но ее активность частично охарактеризована. Сообщалось об активности экстрактов зародышей пшеницы [17], клеток асцита Krebs II мыши [21], лизата ретикулоцитов кролика [22], [23], [24], а также в ядре и цитоплазме клеток HeLa [17]. Унлинказа имеет отличительные черты бонафидного фермента, поскольку активность зависит от Mg 2+ или Mn 2+ [17], [22] и ингибируется в присутствии ванадата, SDS, Zn 2+ и ЭДТА [22], [24].Восстановители, ингибиторы трансляции, ингибиторы РНКазы и протеазы, по-видимому, не влияют на активность унлинказы [22]. Неизвестно, является ли унлинказная активность результатом одного фермента, комплекса гетеро- или гомо-мультимеров или комплекса РНП с вирусной РНК. Частично очищенные препараты фермента дали низкие числа оборачиваемости, что позволяет предположить, что очищенный белок был только компонентом потенциального комплекса или что ответственный фермент выполняет совершенно иную функцию в неинфицированной клетке и расщепляет связь тирозил-РНК в геноме пикорнавируса. РНК — это просто второстепенная роль фермента [18].Также было продемонстрировано, что длина присоединенной РНК, а не целостность VPg, более важна для эффективного расщепления унлинказы [18], [19]. На сегодняшний день описана активность унлинказы для распознавания и отщепления VPg от геномной РНК энтеровирусов [17], [18], кардиовирусов [25] и афтовирусов [22]. Активность очень специфична для фосфодиэфирной связи тирозил-РНК, поскольку связь тирозил-ДНК не расщепляется в присутствии унлинказы [неопубликованные данные, [20]], а связь серин-РНК вируса мозаики коровьего гороха не является членом подсемейства вируса Comovirinae [21], [26].

Ключевой нерешенной проблемой является роль отщепления VPg от РНК вириона унлинказой в цикле репликации пикорнавирусов. VPg отщепляется от геномов пикорнавирусной РНК, которым суждено служить в качестве матриц для трансляции; вирусный белок сохраняется на матрицах для репликации, а также в инкапсидированных геномах [8], [27], [28], [29], [30], [31]. VPg, однако, не отщепляется от субстратов VPg-pU и VPg-pUpU (которые обычно служат праймерами для репликации во время инфекции) [18], [19].Мы предполагаем, что активность unlinkase используется пикорнавирусами, чтобы отличать шаблоны для трансляции от тех, которые должны служить в качестве шаблонов для репликации или которые инкапсидированы в вирионы для дальнейших раундов заражения. Эта гипотеза также поддерживает возможность того, что VPg играет роль в инкапсидации генома.

Чтобы проверить гипотезу о том, что активность унлинказы необходима для дифференциации матриц для трансляции от матриц, которые будут использоваться при репликации, необходимо очистить и идентифицировать фермент, ответственный за эту активность.Несмотря на интенсивные усилия нашей лаборатории и других исследовательских групп, эта работа все еще продолжается. Однако, хотя фермент не был идентифицирован, дальнейшая характеристика активности была проведена. Мы разработали новый анализ, который визуализирует миграцию радиоактивно меченного 35 S-метионина субстрата VPg-РНК, генерируемого in vivo , чтобы определить, присутствует ли унлинказная активность. Здесь мы сообщаем, что активность унлинказы может быть обнаружена с помощью этого анализа, и подтверждаем предыдущие сообщения о том, что полноразмерная РНК вириона является гораздо более эффективным субстратом, чем VPg-нонануклеотидный субстрат.Мы также демонстрируем, что эта уникальная активность остается неизменной в течение полиовирусной инфекции в клетках HeLa и что на нее не влияет присутствие экзогенных VPg или анти-VPg антител. Кроме того, мы определили, что унлинказа распознает и расщепляет химерный субстрат человеческого риновируса-полиовируса с той же эффективностью, что и субстрат полиовируса.

Материалы и методы

Экстракты, частично очищенные фракции унлинказы, VPg синтетического полиовируса и антитела

Цитоплазматический экстракт для анализа на унлинказу получали из клеточных линий HeLa, NGP, SK-OV-3 и K562.Клетки HeLa [32], [33] выращивали в суспензионной культуре в SMEM с добавлением 8% сыворотки новорожденного теленка (NCS), клетки K562 [34] выращивали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS), клетки NGP [ 35], [36] выращивали в среде DMEM с добавлением 20% FBS. Монослои клеток SK-OV-3 (номер американской коллекции типовых культур: HTB-77) выращивали в среде RPMI с добавлением 12% FBS. Клетки осаждали, промывали 1X PBS и обрабатывали цитоплазматическим препаратом S10, как описано в другом месте [37].Однако экстракты, использованные для дальнейшей очистки унлинказы, не подвергались обработке микрококковой нуклеазой, а вместо этого использовались для получения фракции промывной рибосомальной соли (RSW). Для приготовления RSW цитоплазматический экстракт клеток HeLa S10 центрифугировали при максимальной RCF 370 500 × g в течение одного часа при 4 ° C. Супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали в 1X гипотоническом буфере (20 мМ HEPES, pH 7,4, 10 мМ MgOAc, 1 мМ DTT) и доводили до OD 260 нм 240-480 единиц / мл (1 мкл образца ресуспендирование в 400 мкл 1X гипотонического буфера соответствует OD 260 нм ( единиц / мл).KCl добавляли до конечной концентрации 0,5 М и смесь инкубировали при 4 ° C в течение 15 минут. Затем ресуспендированный осадок снова центрифугировали при максимальной RCF 370 500 × g в течение одного часа при 4 ° C. Супернатант собирали и диализовали в буфере унлинказы (20 мМ Трис-Cl, pH 7,5, 1 мМ DTT, 5% глицерин). Диализированные фракции хранили при -80 ° C. Лизат ретикулоцитов кролика, обработанный микрококковой нуклеазой, был получен от Promega.

Для получения цитоплазматических экстрактов из инфицированных клеток клетки HeLa в суспензионной культуре осаждали и дважды промывали 1X PBS.Гранулированные клетки ресуспендировали в половине необходимого общего объема бессывороточного SMEM и инфицировали полиовирусом дикого типа при множественности инфицирования (MOI) 20; адсорбция происходила при комнатной температуре в течение 30 минут. После адсорбции добавляли 8% NCS, оставшуюся среду и HEPES, pH 7,4 (конечная концентрация 20 мМ); заражение проводилось при 37 ° C. Цитоплазматические экстракты S10, полученные из инфицированных полиовирусом клеток HeLa через 0, 2, 4 и 6 часов после инфицирования, а также через 0 и 6 часов из ложно инфицированных клеток HeLa, получали, как описано [37], с за исключением того, что они не подвергались обработке микрококальной нуклеазой.

Для получения частично очищенных, обогащенных фракций активности нлинказы с помощью катионо-анионообменной хроматографии (фракция CA), RSW подвергали катионообменной хроматографии (SP Sepharose FF, GE Healthcare), и белки элюировали из колонки с использованием возрастающей концентрации NaCl в унлинказном буфере. Белковые фракции диализовали против унлинказного буфера и анализировали на активность унлинказы. Пиковые фракции объединяли, подвергали анионообменной хроматографии (AEC) (DEAE Sepharose FF, GE Healthcare), и белки элюировали с использованием возрастающих концентраций NaCl в унлинказном буфере.Белковые фракции диализовали в буфере унлинказы и анализировали на активность унлинказы; Затем фракции, содержащие пиковую активность, использовали в дальнейших анализах.

Для получения частично очищенных, обогащенных фракций активности нлинказы с использованием фракционирования в градиенте сахарозы и анионообменной хроматографии (фракция SA), RSW первоначально применяли к одному из двух градиентов: 7% -47% сахарозы (20 мМ Трис, pH 7,5). , 5 мМ MgCl 2 , 100 мМ KCl) или 15–30% сахарозы (20 мМ Трис pH 7,5, 5 мМ MgCl 2 , 100 мМ KCl).Градиентное центрифугирование проводили в роторе Beckman SW41 при 32000 об / мин в течение трех часов при 4 ° C. Фракции собирали, диализовали в буфере унлинказы и анализировали на активность унлинказы. Фракции, демонстрирующие самые высокие уровни активности унлинказы из градиентов сахарозы, объединяли и подвергали анионообменной хроматографии (DEAE Sepharose FF, GE Healthcare), и белки элюировали с использованием возрастающих концентраций NaCl в унлинказном буфере. Белковые фракции диализовали в буфере унлинказы и анализировали на активность унлинказы; Затем фракции, содержащие пиковую активность, использовали в дальнейших анализах.

Синтетический пептид VPg полиовируса был произведен BioBlocks, Сан-Диего, Калифорния. Этот синтетический пептид использовали для получения поликлональных антител против VPg у кроликов (Bethyl Laboratories).

Клонирование, транскрипция и трансфекция химеры человеческого риновируса 14-полиовируса S1-VPgR1

Выбор сайта для метиониновых мутаций в кодирующей области VPg HRV14 был основан на ранее опубликованных работах [38], [39], [40]. Плазмида кДНК полиовируса, pT7PV1, была мутирована (таблица 1: олигонуклеотиды 1–4), чтобы фланкировать последовательность, кодирующую VPg, с сайтами рестрикции PpuMI и ApaI.Нативная кодирующая область VPg полиовируса была вырезана с использованием сконструированных сайтов рестрикции PpuMI и ApaI, заменена картриджем HRV14 VPg M [6], [17], который состоит из двух пар перекрывающихся комплементарных олигонуклеотидов (Таблица 1: олигонуклеотиды 5-8 ) и клонировали в очищенную в геле линейную матрицу за одну реакцию лигирования. Последовательность конечного продукта, pT7-S1-VPgR1, проверяли секвенированием ДНК с использованием олигонуклеотида 9 (таблица 1).

Матрицу pT7-S1-VPgR1 линеаризовали с помощью EcoRI, экстрагировали фенолом / хлороформом, осаждали этанолом и транскрибировали in vitro .Серийные разведения реакции транскрипции инкубировали с 1 мг / мл DEAE-декстрана в буфере TS (19 мМ Трис-HCl, 4,4 мМ KCl, 0,4 мМ Na 2 HPO 4 , 137 мМ NaCl, 490 мМ MgCl 2 , 0,7 мМ CaCl ( 2 , доведено до pH 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре, и 250 мкл этих смесей использовали для трансфекции монослоев клеток HeLa в 60-миллиметровых планшетах в течение 30 минут при комнатной температуре. После трансфекции монослои перекрывали DMEM с добавлением 10% FBS и 0.45% агарозы и инкубировали при 37 ° C. Через шестьдесят часов после трансфекции бляшки выделяли и использовали для инфицирования монослоев клеток HeLa с целью создания вирусных запасов. Титры вирусов определяли с помощью анализа бляшек. Исходные вирусные растворы пассировали три раза, и исходный раствор P4 использовали для получения очищенного субстрата унлинказы. Чтобы убедиться, что мутация VPg сохраняется после трансфекции и пассирования мутантного вируса S1-VPgR1, монослои клеток HeLa инфицировали при MOI 25 в течение 5,5 часов и общую клеточную РНК экстрагировали с использованием реагента TRI (Molecular Research Center, Inc.) и подвергали ОТ-ПЦР (Таблица 1: олигонуклеотид 9) для получения фрагмента вирусной кДНК. Фрагмент кДНК амплифицировали с помощью ПЦР (таблица 1: олигонуклеотиды 9 и 10), а затем подвергали секвенированию ДНК.

Получение субстратов РНК вириона пикорнавирусов

Меченная S-метионином РНК вириона 35 из вирусов W1-VPg31 [38], [39] и S1-VPgR1 получали следующим образом: Клетки HeLa в суспензионной культуре готовили для заражения, как описано выше, за исключением использования DMEM без метионина (MP Biomedicals).Инфицированные клетки HeLa лишались метионина в течение двух часов при 37 ° C после адсорбции, а затем добавляли 1 мКи 35 S-метионина. Через шесть часов после инфицирования клетки осаждали и ресуспендировали в буфере RSB + Mg 2+ (0,01 М NaCl, 0,01 М трис-Cl, pH 7,5, 1,5 мМ MgCl 2 ). Ресуспендированный осадок пять раз оттаивали замораживанием и снова центрифугировали для получения ядер осадка и клеточного дебриса. Супернатант собирали, и осадок снова промывали буфером RSB + Mg 2+ , центрифугировали, и полученный супернатант объединяли с исходным супернатантом.Супернатант центрифугировали в роторе Beckman Ti 70 при 24 ° C и 29700 об / мин в течение 3,5 часов для осаждения вирионов. Полученный супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали в 0,1 буфере (0,1 М NaCl, 10 мМ трис-Cl, pH 7,5, 5 мМ ЭДТА, 0,5% ДСН), нанося 15-30% градиент сахарозы (5 мМ ЭДТА, 0,1 M NaCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,5% SDS) и центрифугировали при 27700 об / мин в роторе Beckman SW41 в течение 2,5 часов при 24 ° C. Собирали фракции градиента и определяли радиоактивность каждой фракции сцинтилляционным счетом; пиковые фракции объединяли и подвергали двум циклам экстракции фенолом / хлороформом и осаждению этанолом.Конечный объем препарата РНК вириона доводили до 700 имп / мин / мкл (~ 0,15 пмоль / мкл).

VPg-нонануклеотидный субстрат получали путем переваривания полноразмерного субстрата РНКазой T1 (200 единиц) в течение одного часа при 37 ° C в TM буфере (30 мМ Tris-Cl, pH 7,5, 10 мМ MgCl 2 ). Затем эту смесь непосредственно добавляли к источнику унлинказы или РНКазе A (Sigma) в анализах.

Одноцикловый анализ вирусного роста

Монослои клеток HeLa [41] дважды промывали 1X PBS и инфицировали либо полиовирусом, либо вирусом S1-VPgR1 при множественности инфицирования (MOI) 20.После 30-минутного периода адсорбции при комнатной температуре клетки трижды промывали 1X PBS для удаления неадсорбированного вируса, а затем покрывали DMEM с добавлением 10% FBS. Заражение проводилось при 37 ° C. Через 0, 2, 4 и 6 часов после инфицирования клетки соскабливали и собирали со средой. Суспензии клеток были подвергнуты пяти циклам замораживания-оттаивания, и общее количество бляшкообразующих единиц было определено с помощью анализа бляшек.

Анализ активности унлинказы и конкурентные тесты

Для каждого эксперимента эквивалент 700 импульсов в минуту (∼0.15 пмоль) / реакция радиоактивно меченного субстрата. VPg из химеры полиовируса-риновируса был помечен по-разному по сравнению с W1-VPg31; для компенсации специфические активности препаратов вирусной РНК были сопоставлены путем добавления очищенной немеченой РНК вириона W1-VPg31 к радиоактивно меченной РНК вириона W1-VPg31. Конечные физические количества РНК для каждой реакции были равны. Если не указано иное, субстрат затем инкубировали с 20 мкг белка из источника унлинказы в присутствии 2 мМ MgCl 2 в течение 30 минут.Реакционные смеси из экспериментов с полноразмерным или VPg-нонануклеотидным субстратом разделяли с помощью анализа 13,5% трис-трицина в ПААГ. Гели сушили сразу после электрофореза. После авторадиографии с использованием экрана фосфорного визуализатора результаты анализировали с использованием программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad).

Для конкурентных анализов 0,1, 0,5 или 1,0 мкг экзогенного синтетического полиовируса VPg предварительно инкубировали с 20 мкг белка из RSW (в качестве источника унлинказы) в течение 15 минут при 30 ° C перед добавлением 35 S -метионин-меченный субстрат РНК вириона W1-VPg31; реакционную смесь инкубировали в течение дополнительных 10 минут при 30 ° C перед тем, как продукты подвергали воздействию 13.5% -ный анализ трис-трицина в ПААГ, как описано ранее.

Результаты

Оптимальные условия анализа для определения активности унлинказы с использованием полноразмерной РНК вириона полиовируса

35 Субстрат, меченный S-метионином

Мы выбрали подход радиомечения мутантного полиовируса W1-VPg31 (рис. 1B), чтобы четко визуализировать высвобождение VPg из субстрата VPg-РНК. Этот подход также позволяет исследовать расщепленный VPg, поскольку неочищенные препараты унлинказы из клеточных экстрактов содержат протеазу, которая расщепляет свободный VPg [24].Ранее описанный метод определения активности унлинказы посредством измерения распределения высвободившейся РНК на фенольную фазу является проблематичным из-за потенциальной деградации VPg; продукты, возникающие в результате разделения протеолиза в водную фазу, возможно, приводят к неоднозначной интерпретации данных [22], [24].

Чтобы определить оптимальные условия для полного переваривания субстрата пикорнавируса с помощью нашего нового анализа, мы протестировали различные концентрации белка обогащенного источника активности унлинказы, а также разное время инкубации реакции.Возрастающие концентрации фракции белка, обогащенного немлинказой (фракция SA), инкубировали с радиоактивно меченным субстратом W1-VPg31 (рис. 2A), и мы определили, что 0,4 мкг / мкл, или 20 мкг в целом, были оптимальной концентрацией для полного переваривания полной субстрата полиовируса (фиг. 2A, дорожка 6), когда реакционной смеси давали инкубироваться при 30 ° C в течение 30 минут. Чтобы подтвердить, что 30 минут были подходящим временем инкубации для активности унлинказы на радиоактивно меченом субстрате, был проведен временной анализ с использованием концентрации 0.Было выполнено 4 мкг / мкл (рис. 2В). Этот анализ подтвердил, что 30 минут были оптимальными для полного расщепления субстрата (рис. 2В, дорожка 8). Следовательно, концентрации 0,4 мкг / мкл частично очищенного источника унлинказы, инкубированного в течение 30 минут при 30 ° C, достаточно для достижения полного расщепления радиоактивно меченного субстрата.

Рис. 2. Оптимальные условия анализа для определения активности унлинказы с использованием полноразмерной РНК вириона полиовируса 35 меченного S-метионином субстрата.

Фракция хроматографии белка, обогащенная унлинказной активностью, инкубировалась с полноразмерным радиоактивно меченным субстратом РНК вириона W1-VPg 31 S-метионина 35 с любым из (A) возрастающих количеств белка (0,01, 0,02, 0,04, 0,1, 0,2, 0,4 и 0,6 мкг / мкл) из обогащенного источника активности унлинказы (фракция SA) при 30 ° C в течение 30 минут или (B) увеличивающееся время инкубации (0, 1, 2, 5, 10, 15, 20 и 30 минут) с 0,4 мкг / мкл белка из частично очищенной фракции унлинказной активности (фракция SA) для определения оптимальных условий анализа для полноразмерного субстрата.(C) 35 Радиоактивно меченный S-метионином субстрат РНК вириона W1-VPg 31 инкубировали ложно (дорожка 1), инкубировали с 0,8 мкг / мкл RSW (дорожка 2), 0,4 мкг / мкл белка из частично очищенной фракции. активности унлинказы (фракция SA) (дорожка 3) или одна единица РНКазы A (дорожка 4), чтобы различать неспецифическую нуклеазную активность и подлинную активность унлинказы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016559.g002

Чтобы исключить возможность того, что активность унлинказы, которую мы наблюдали в нашем анализе, была результатом неспецифической нуклеазы, мы инкубировали субстрат полиовируса с РНКазой. A (однонитевой нуклеазой) и сравнил миграцию полученного радиоактивно меченного продукта VPg с продуктом VPg, который возник, когда наш субстрат инкубировали с источником активности унлинказы.Радиоактивно меченый субстрат W1-VPg31 инкубировали с RSW (рис. 2C, дорожка 2), белком из частично очищенной фракции унлинказы (фракция SA) (рис. 2C, дорожка 3) или РНКазой A (рис. 2C, дорожка 4). Ожидается, что обработка РНКазой А приведет к образованию продукта VPg-pUp, поскольку РНКаза не может удалить последний присоединенный нуклеотид из меченого VPg. В соответствии с этим предсказанием, полученный продукт (обозначенный стрелкой) образует полосу, которая мигрирует с немного меньшей электрофоретической подвижностью, чем продукт радиоактивно меченного субстрата, обработанного источником унлинказы (Рисунок 2C, сравните дорожку 4 с дорожками 2 и 3). .Кроме того, значительные уровни интактной РНК вириона присутствуют при инкубации с высокообогащенными фракциями унлинказной активности, что дополнительно указывает на то, что наши результаты расщепления VPg не связаны с неспецифической нуклеазой (данные не показаны).

Полноразмерная геномная РНК полиовируса является более эффективным субстратом, чем РНК вириона, обработанная РНКазой T1

Другие исследователи продемонстрировали, что VPg, присоединенный к первым девяти нуклеотидам генома полиовируса, полученный обработкой полноразмерного субстрата РНКазой T1, является подходящим, хотя и неэффективным, субстратом для активности унлинказы [18], [19].В наших первоначальных исследованиях мы использовали этот VPg-нонануклеотидный субстрат для определения наличия и уровней активности унлинказы. Наше обоснование для использования этого субстрата состояло в том, чтобы визуализировать уровни высвобожденного VPg по сравнению с субстратом полноразмерной VPg-РНК в наших трис-трицин-полиакриламидных гелях, поскольку полноразмерная РНК вириона не должна входить в такой матрикс. Однако по сравнению с полноразмерным, мы определили, что эффективность удаления VPg из усеченного VPg-нонануклеотидного субстрата была заметно снижена (рис. 3A, сравните дорожки 1 и 5) с использованием RSW в качестве источника активности унлинказы.При обработке РНКазой Т1 полноразмерная РНК вириона полиовируса вырабатывала три меченых продукта, причем продукт с самой медленной миграцией был наиболее заметным (рис. 3А, дорожка 2). Вероятно, что этот более крупный продукт представляет собой нонануклеотидный субстрат VPg, а менее заметные полосы являются результатом чрезмерного переваривания РНКазы T1, которая в первую очередь распознает и расщепляет 3′-одноцепочечные остатки гуанидина, но также может расщеплять одноцепочечный аденозин. остатков, если РНКаза Т1 присутствует в избыточных количествах.Интересно, что расщепление этого усеченного субстрата является неполным в присутствии насыщающих количеств RSW (фиг. 3A, сравните дорожки 1 и 5). Фактически наблюдается промежуточное звено (рис. 3А, дорожки 3–5). Для сравнения (рис. 3В) полноразмерный субстрат полиовируса, который не был предварительно обработан РНКазой Т1, имеет VPg, эффективно отщепляющийся от РНК вириона в присутствии унлинказы; промежуточных продуктов не наблюдается (рис. 3В, дорожки 2–4). Мы также наблюдали нерасщепленный полноразмерный субстрат РНК вириона (рис. 3В), хотя он был захвачен в верхней части разделяющего геля и не мог попасть в матрицу.Кроме того, при более высоких концентрациях RSW (рис. 3A, дорожка 5 и рис. 3B, дорожка 4) наблюдалась деградация большего количества свободного VPg неидентифицированной клеточной протеазой [24]; мы наблюдаем сниженную протеолитическую деградацию высвобожденного VPg по мере дальнейшей очистки унлинказной активности (данные не показаны). Основываясь на этих данных, мы делаем вывод, что полноразмерная РНК вириона полиовируса не только является более эффективным субстратом для активности унлинказы, чем VPg-нонануклеотидный субстрат, но и более короткий субстрат образует промежуточный продукт, который не может быть расщеплен унлинказой, подтверждая, что длина РНК играет роль в активности этого фермента.

Рис. 3. Сравнение эффективности усеченного и полноразмерного субстрата, меченного S-метионином.

35 Радиоактивно меченный S-метионином субстрат W1-VPg 31, обработанный РНКазой T1 (A) или необработанный (B), инкубировали с возрастающими количествами общего белка из RSW (0, 5, 10 и 20 мкг) в качестве источник активности унлинказы для демонстрации эффективности укороченного субстрата по сравнению с полноразмерным субстратом.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0016559.g003

Активность унлинказы остается неизменной при полиовирусной инфекции клеток HeLa

Хотя сообщалось, что активность унлинказы не изменялась в более поздние сроки после заражения полиовирусом [17], [19], было неясно, в какое время во время заражения анализировалась активность унлинказы, и мог ли более чувствительный анализ выявить незначительные различия. в активности над типичной пикорнавирусной инфекцией. Чтобы ответить на эти нерешенные вопросы, мы провели заражение клеток HeLa полиовирусом дикого типа и получили цитоплазматические экстракты из инфицированных клеток через ноль, два, четыре или шесть часов после заражения.Затем эти экстракты анализировали на унлинказную активность (рис. 4). При сравнении с ложно инфицированными клетками, собранными через 0 и 6 часов после заражения (рис. 4, дорожки 1, 2, 7 и 8), не наблюдалось заметной разницы в активности унлинказы между разными временными точками, когда 1 мкг (рис. , дорожки 3–6) или 5 мкг (рис. 4, дорожки 9–12) общего белка из экстракта. Мы пришли к выводу, что активность унлинказы остается неизменной с течением времени полиовирусной инфекции, по крайней мере, в условиях, которые мы использовали.

Рис. 4. Активность унлинказы остается неизменной во время полиовирусной инфекции.

клеток HeLa инфицировали полиовирусом дикого типа, и цитоплазматические экстракты собирали через 0 (дорожки 3 и 9), 2 (дорожки 4 и 10), 4 (дорожки 5 и 11) или 6 (дорожки 6 и 12) часов после -инфекционное заболевание. 1 мкг (дорожки 1–6) или 5 мкг (дорожки 7–12) общего белка из этих экстрактов инкубировали с полноразмерным радиоактивно меченным субстратом РНК вириона W1-VPg 31 вириона 35 S-метионина. Не наблюдали разницы в активности между ложными дорожками (дорожки 1, 2, 7 и 8) и разными временными точками, собранными во время инфекции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016559.g004

Экстракты из разных линий клеток человека имеют разные уровни активности унлинказы

Используя наш недавно разработанный анализ, мы хотели определить, варьируются ли уровни активности унлинказы в экстрактах, приготовленных из разных линий клеток человека. Мы протестировали цитоплазматические экстракты из клеток человека (рис. 5: HeLa, дорожки 1-3, SK-OV-3, дорожки 4–6, NGP, дорожки 7–9, K562, дорожки 13–15) с использованием нашего радиоактивно меченного субстрата W1-VPg31. и обнаружил, что активность унлинказы варьируется в разных линиях клеток человека.Наивысшие уровни активности унлинказы наблюдались в цитоплазматическом экстракте клеток HeLa (рис. 5, дорожки 1–3) и клеток K562 (рис. 5, дорожки 13–15). Цитоплазматический экстракт NGP (рис. 5, дорожки 7–9) проявлял более низкие уровни активности унлинказы, чем клетки HeLa или K562; цитоплазматический экстракт из клеток SK-OV-3 (фиг. 5, дорожки 4–6) обнаружил самые низкие уровни унлинказной активности среди различных исследованных линий клеток человека. Хотя уровни активности унлинказы различаются, нельзя установить корреляцию между уровнями активности унлинказы и инфекционностью клеточной линии.Клетки HeLa с наивысшими уровнями наблюдаемой активности унлинказы и клетки NGP, у которых наблюдалась более низкая активность унлинказы, поддерживают успешную инфекцию полиовируса [42]. Напротив, вирусный рост несколько ограничен в клетках SK-OV-3, которые, как было обнаружено, имеют низкие уровни активности унлинказы [43]; Инфекция полиовирусом или риновирусом клеток K562, которые проявляют высокий уровень активности унлинказы, приводит к персистирующей инфекции [44].

Рисунок 5. Активность унлинказы в различных цитоплазматических экстрактах из линий клеток человека.

Увеличение количества общего белка (0,1 мкг / мкл, дорожки 1, 4, 7, 10 и 13; 0,2 мкг / мкл, дорожки 2, 5, 8, 11 и 14; 0,4 мкг / мкл, дорожки 3, 6, 9, 12 и 15) цитоплазматических экстрактов из различных клеточных линий инкубировали с радиоактивно меченным субстратом РНК вириона W1-VPg 31 35 S-метионином. HeLa (дорожки 1–3), SK-OV-3 (дорожки 4–6), NGP (дорожки 7–9) и K562 (дорожки 13–15) — все линии клеток человека и имеют разные уровни активности унлинказы; RRL (лизат ретикулоцитов кролика) (дорожки 10–12), в отличие от предыдущих публикаций, не проявлял активности унлинказы в этом анализе (дорожки 10–12).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016559.g005

Лизат ретикулоцитов кролика (RRL), который, как сообщалось, обладает активностью унлинказы [3], [22], [24], был включен в качестве контроль, но мы не смогли обнаружить активность унлинказы с помощью нашего анализа (рис. 5, дорожки 10–12). Этот результат был согласован во многих экспериментах и ​​не изменился, если RRL не обрабатывали микрококковой нуклеазой перед инкубацией с нашим радиоактивно меченным субстратом (данные не показаны).Из этих экспериментов мы пришли к выводу, что активность унлинказы варьируется в клетках человека, но это изменение активности, по-видимому, не связано со способностью клетки-хозяина поддерживать успешную пикорнавирусную инфекцию.

Экзогенный VPg не влияет на активность унлинказы

Исследования с использованием протеиназы К для расщепления белка VPg на РНК пикорнавируса, при сохранении неповрежденной фосфодиэфирной связи тирозил-РНК, показывают, что длина присоединенного VPg не важна для распознавания унлинказы [18], [19].Однако эти эксперименты могут не учитывать характеристики VPg. VPg — это высокоосновной белок, который, вероятно, ассоциируется с отрицательно заряженным остовом соседней молекулы РНК; возможно, что это взаимодействие маскирует фосфодиэфирную связь тирозил-РНК от унлинказы. При расщеплении большей части связывающего VPg и, следовательно, увеличении воздействия ковалентной связи тирозил-РНК, протеиназа К может усиливать активность унлинказы. Основываясь на уникальных характеристиках VPg и его потенциально сильном взаимодействии с соседней РНК пикорнавируса, мы предположили, что существует компонент унлинказы, который специфически распознает и диссоциирует VPg от РНК, чтобы демаскировать связь тирозил-РНК.Чтобы проверить эту гипотезу, экзогенный VPg был добавлен в качестве потенциального конкурента для реакций с использованием RSW в качестве источника унлинказы (Рисунок 6, сравните дорожку 1 с дорожками 2–4). Мы не наблюдали влияния на эффективность расщепления полноразмерного радиоактивно меченого субстрата РНК, только более медленную миграцию высвобожденного радиоактивно меченного VPg из-за избытка ко-мигрирующего немеченого небольшого вирусного белка (рис. 6, дорожки 2–4). . Кроме того, антитела, специфичные к VPg полиовируса, не мешали реакции унлинказы (данные не показаны).Мы пришли к выводу, что полноразмерный VPg не играет значительной роли в активности унлинказы.

Рисунок 6. Экзогенный полиовирус VPg не влияет на активность унлинказы.

Возрастающие количества (0, 0,1, 0,5 и 1,0 мкг) экзогенного синтетического пептида VPg полиовируса добавляли к полноразмерному субстрату, меченному S-метионином W1-VPg 31, РНК вириона и RSW (0,4 мкг / мкл или 20 мкг всего) в качестве источника унлинказы. Ни добавление экзогенного вирусного пептида (дорожки 2–4), ни добавление антител против VPg не влияло на активность унлинказы (данные не показаны).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016559.g006

Унлинказная активность расщепляет субстрат риновируса человека с такой же эффективностью, как субстрат полиовируса

Чтобы определить, может ли активность унлинказы распознавать и расщеплять субстрат риновируса человека, мы разработали химерный вирус, состоящий из генома полиовируса, который кодирует VPg риновируса 14 (HRV 14) человека; риновирус VPg также был мутирован, чтобы кодировать два остатка метионина для радиоактивной метки.Мы разработали этот химерный вирус, названный S1-VPgR1 (рис. 7A), из-за сложности создания достаточного количества очищенной РНК вириона из клеток HeLa, инфицированных риновирусом человека. Кинетика роста определила, что эта вирусная химера имеет несколько более медленный фенотип роста через четыре часа после заражения по сравнению с полиовирусом дикого типа в одноцикловом анализе роста, но эта разница устраняется через шесть часов после заражения, когда вирионы собирают для вирусной РНК. очистка (рис. 7В).S1-VPgR1 использовали для заражения клеток HeLa в присутствии 35 S-метионина и очищали РНК вириона. Обработанная T1 РНК вириона (фигура 7C) или полноразмерная РНК вириона (фигура 7D) из радиоактивно меченных субстратов W1-VPg31 и S1-VPgR1 инкубировали с источником унлинказы, чтобы определить, различалась ли эффективность расщепления между двумя вирусами. Субстраты, генерируемые РНКазой T1 из обоих вирусов (рис. 7C), инкубировали с 0, 5, 10 или 20 мкг общего белка из источника обогащенной активности унлинказы (фракция CA), и не наблюдали значительной разницы в эффективности расщепления между двумя субстратами. (Рисунок 7C сравнивает дорожки 4 и 8).Полноразмерные субстраты из обоих вирусов (рис. 7D) инкубировали с 0,5, 1, 2, 5 или 10 мкг общего белка из одного и того же источника обогащенной активности унлинказы, и снова не наблюдали значительных различий в расщеплении между двумя субстратами ( На рис. 7D сравниваются дорожки 6 и 12). Не наблюдалось различий в отношении расщепления унлинказы любого из субстратов, что привело к заключению, что этот фермент может распознавать и расщеплять субстрат риновируса человека.

Рисунок 7. Унлинказная активность полиовируса в сравнении с субстратом риновируса.

(A) Последовательности VPg HRV14 и S1-VPgR1 (полиовирус дикого типа, мутировавший для кодирования VPg HRV14, который кодирует два остатка метионина). (B) Одноцикловый анализ роста полиовируса дикого типа (закрашенные кружки) и S1-VPgR1 (закрашенные квадраты). 35 Радиоактивно меченный S-метионином субстрат W1-VPg 31 или S1-VPgR1, обработанный РНКазой T1 (C) или необработанный (D), инкубировали с возрастающими количествами общего белка из частично очищенной фракции унлинказной активности (фракция CA ) ((C) 0, 5, 10 и 20 мкг и (D) 0, 0.5, 1, 2, 5 и 10 мкг), чтобы продемонстрировать, что активность унлинказы одинаково распознает каждый субстрат.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016559.g007

Обсуждение

Связывание белка с нуклеиновой кислотой, в конечном итоге приводящее к образованию фосфодиэфирной связи, не является уникальным событием, что подтверждается несколькими семействами вирусов, прокариотами и эукариотическими клетками. Однако ферменты, которые распознают и расщепляют эту связь, гораздо более необычны. О таких ферментах сообщалось у прокариот, белки которых регулируются уридилилированием.Уридил-удаляющие и уридилилтрансферазные ферменты участвуют в прокариотической регуляции глутаминсинтетазы [45] и метаболизма галактозы [46], [47]. На сегодняшний день у эукариот идентифицированы две тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы: тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (Tdp1) и тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 2 (ранее TTRAP), которые в первую очередь распознают и расщепляют 3′- и 5′-фосфодиэфирные связи тирозил-ДНК. соответственно [13], [14], [15], [16]. РНК-тирозилфосфодиэстеразы не идентифицированы; тем не менее, есть неопровержимые доказательства того, что по крайней мере одна такая активность существует в клетках млекопитающих, что продемонстрировано удалением 5′-концевого VPg из геномных РНК пикорнавирусов.Можно предположить, что одна из уже идентифицированных тирозил-ДНК-фосфодиэстераз также ответственна за эту активность тирозил-РНК-фосфодиэстеразы, но это не так. Мы определили, что Tdp1 не распознает и не расщепляет субстрат тирозил-РНК пикорнавируса, а источник унлинказы не расщепляет субстрат Tdp1 (данные не показаны). Кроме того, множественные масс-спектрометрические анализы подтвердили, что ни Tdp1, ни TTRAP не обнаруживаются ни в каких белковых препаратах, содержащих повышенную активность унлинказы (данные не показаны).Эти данные не удивительны, поскольку ранее было продемонстрировано, что унлинказа распознает и расщепляет очень специфическую связь 5′-тирозил-РНК; он не может расщеплять синтетически созданную связь 5′-тирозил-ДНК [20], а также не может расщеплять связь серин-РНК [21], [26].

Хотя идентичность унлинказы еще предстоит определить, ее активность была частично охарактеризована. До сих пор неизвестно, является ли эта ферментативная активность результатом одного белка, мультибелкового комплекса или даже, возможно, рибонуклеопротеинового комплекса.Мы подтвердили, что большая длина присоединенной к VPg РНК увеличивает эффективность унлинказной активности. Почему увеличение длины геномной РНК увеличивает эффективность, в настоящее время неизвестно. Возможно, что другие последовательности и / или структуры в геноме пикорнавируса усиливают распознавание субстратной связи или что для правильной стыковки фермента требуется большая длина РНК (потенциально комплекс). Мы исследовали возможность активности унлинказы в результате того, что геном пикорнавируса действует как рибозим, но мы не смогли найти никаких доказательств, подтверждающих эту гипотезу (данные не показаны).Независимо от механизма, фактор хозяина вносит вклад в активность несвязки и все же должен быть идентифицирован.

Мы определили, что унлинказа может успешно распознавать и расщеплять химерный субстрат пикорнавируса, который имеет 14 VPg риновируса человека, ковалентно присоединенный к геному полиовируса. При учете специфической активности двух субстратов пикорнавируса белковая фракция, обогащенная по активности унлинказы, не имела предпочтения ни для полиовируса, ни для химерного субстрата риновируса-полиовируса, даже несмотря на то, что идентичность аминокислотной последовательности между двумя последовательностями VPg составляет только 44%.Вывод о том, что ковалентно присоединенная РНК более важна, чем белок VPg, подтверждают наши данные, демонстрирующие, что активность унлинказы остается неизменной в присутствии экзогенных синтетических VPg, а также антител против VPg. Экзогенный VPg был неспособен изолировать активность унлинказы, что привело к заключению, что только VPg, продукт этой реакции, не взаимодействует с компонентом (ами) активности.

Мы хотели определить, изменился ли уровень активности унлинказы в экстрактах, полученных из различных линий клеток человека, по сравнению с экстрактом клеток HeLa.Было установлено, что в зависимости от тестируемой клеточной линии активность действительно различалась. K562, линия кроветворных клеток человека, имеет уровни активности унлинказы, сравнимые с таковой в клетках HeLa. Цитоплазматические экстракты из клеток SK-OV-3, линии клеток карциномы яичника, и клеток NGP, линии клеток нейробластомы, имели значительно меньшую активность унлинказы по сравнению с клетками HeLa. Примечательно, что уровни активности унлинказы нельзя коррелировать с инфекционностью пикорнавируса; Значимость измененных уровней активности унлинказы в тестируемых клеточных линиях еще предстоит определить.В качестве контроля мы также тестировали активность в лизате ретикулоцитов кролика (RRL). Несколько групп сообщили о наличии унлинказной активности в RRL, но мы не смогли повторить эти результаты, используя наш анализ и условия. Наша работа не является первым признаком того, что RRL имеет ограниченную активность унлинказы в течение короткого времени инкубации [24], [48]. Возможно, что для достижения расщепления вирусного субстрата необходимо значительно больше белка из RRL, чем из экстракта клеток человека (правдоподобное объяснение как частичная очистка фермента с использованием RRL в качестве источника не сообщалось) или что гораздо более длительное время инкубации необходимо для наблюдения за расщеплением субстрата.

Мы исследовали возможность того, что активность унлинказы может изменяться в течение пикорнавирусной инфекции клеток HeLa. Наши результаты были несколько неожиданными, поскольку можно было ожидать, что активность унлинказы будет снижаться, поскольку вирус берет на себя контроль над клеточной транскрипцией и трансляционным аппаратом. В дополнение к ожиданию того, что белок (белки), ответственный за активность унлинказы, может быть разложен и не восполнен, мы также рассмотрели возможность того, что активность будет снижаться по мере развития инфекции, обеспечивая больше вирусного субстрата и оставляя меньше унлинказы, доступной для воздействия на экзогенные радиоактивно меченые. субстрат.Однако этого не наблюдалось, поскольку активность унлинказы оставалась постоянной на протяжении всего периода полиовирусной инфекции. Возможно, что уровни унлинказы не изменяются в ходе инфекции, но геномная РНК пикорнавирусов может быть недоступна для активности унлинказы из-за ассоциации с мембранными везикулами в репликационных комплексах или из-за ассоциации с вирусными капсидными белками.

Обоснование того, почему активность унлинказы остается неизменной в течение типичной полиовирусной инфекции, может дать представление о роли активности унлинказы в цикле репликации вируса.Мы предполагаем, что активность unlinkase узурпирована вирусом, чтобы отличить шаблоны для перевода от шаблонов, предназначенных для того, чтобы стать шаблонами репликации или быть инкапсулированными. Если для этой цели используется унлинказная активность, этот механизм может потребоваться только на ранней стадии инфекции, когда критически важно, чтобы матрицы были доступны для синтеза вирусного белка. Было продемонстрировано, что геномы полиовирусов проходят успешный цикл трансляции, прежде чем использоваться в качестве матрицы для репликации [49], [50].В настоящее время неизвестно, отщепляет ли унлинказа VPg от геномной РНК до или после инициации трансляции, но сообщалось, что рибосомы могут связываться с полноразмерной VPg-РНК, хотя это исследование использовало RRL в качестве источника экстракта трансляции [48 ]. Позднее было показано, что RRL продуцирует аберрантные белковые продукты при программировании с помощью РНК вириона полиовируса [51], и предполагается, что он обладает недостаточной активностью унлинказы (рис. 5, дорожки 10–12). Удаление VPg из вирусной РНК предположительно могло бы быть маркером, позволяющим отличить матрицу, которая будет поддерживать, по крайней мере, первоначально, устойчивые уровни синтеза вирусного белка и репликации РНК.Такая эффективность может быть более важной до пика репликации РНК, когда вирусные белки должны выполнять начальные раунды репликации генома пикорнавируса. Как только базальный порог вирусных белков, достаточный для максимального синтеза вирусной РНК, может быть не критичным для поддержания эффективной трансляции вирусных белков. Объяснение того, как пикорнавирусы защищают матрицы репликации РНК и полноразмерные геномы для инкапсидации от удаления VPg из вирионной РНК, объясняется путем связывания репликации и инкапсидации РНК, поскольку было продемонстрировано, что эти вирусные процессы связаны in vitro и [32], [50] ], [52], [53], [54]; возможно, что белки капсида защищают зарождающуюся вирусную геномную РНК от активности унлинказы.

Благодарности

Мы благодарим Ричарда Куна и Эккарда Виммера за подарок вируса W1-VPg31. Мы благодарны Керри Фицджеральду за критические комментарии к рукописи. BLS — старший научный сотрудник Американского фонда астмы.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JMR BLS. Проведены эксперименты: JMR RVS. Проанализированы данные: JMR RVS BLS. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JMR RVS BLS. Написал статью: JMR BLS.

Ссылки

  1. 1. Wimmer E (1982) Связанные с геномом белки вирусов. Ячейка 28: 199–201.
  2. 2. Дрыгин Ю.Ф. (1998) Природные ковалентные комплексы нуклеиновых кислот и белков: некоторые комментарии по практике и теории на пути от хорошо известных комплексов к новым. Nucleic Acids Res 26: 4791–4796.
  3. 3. Петтерссон Р.Ф., Амброс В., Балтимор Д. (1978) Идентификация белка, связанного с формирующейся РНК полиовируса и полиуридиловой кислотой РНК с отрицательной цепью.Дж. Вирол 27: 357–365.
  4. 4. Rothberg PG, Harris TJ, Nomoto A, Wimmer E (1978) O4- (5′-уридилил) тирозин представляет собой связь между геном-связанным белком и РНК полиовируса. Proc Natl Acad Sci U S A 75: 4868–4872.
  5. 5. Flanegan JB, Pettersson RF, Ambros V, Hewlett NJ, Baltimore D (1977) Ковалентное связывание белка с определенной нуклеотидной последовательностью на 5′-конце вириона и репликативных промежуточных РНК полиовируса. Proc Natl Acad Sci U S A 74: 961–965.
  6. 6. Lee YF, Nomoto A, Detjen BM, Wimmer E (1977) Белок, ковалентно связанный с РНК генома полиовируса. Proc Natl Acad Sci U S A 74: 59–63.
  7. 7. Китамура Н., Семлер Б.Л., Ротберг П.Г., Ларсен Г.Р., Адлер С.Дж. и др. (1981) Первичная структура, генная организация и экспрессия полипептидов РНК полиовируса. Природа 291: 547–553.
  8. 8. Номото А., Китамура Н., Голини Ф., Виммер Э. (1977) 5′-концевые структуры РНК полиовириона и мРНК полиовируса различаются только геном-связанным белком VPg.Proc Natl Acad Sci U S A 74: 5345–5349.
  9. 9. Nomoto A, Detjen B, Pozzatti R, Wimmer E (1977) Расположение белка генома полиомиелита в вирусных РНК и его значение для синтеза РНК. Природа 268: 208–213.
  10. 10. Пол А. В., ван Бум Дж. Х., Филиппов Д., Виммер Е. (1998) Синтез РНК, примированный белком, с помощью очищенной РНК-полимеразы полиовируса. Природа 393: 280–284.
  11. 11. Toyoda H, Yang CF, Takeda N, Nomoto A, Wimmer E (1987) Анализ синтеза РНК полиовируса типа 1 с использованием молекулярно-генетического подхода in vitro.J Virol 61: 2816–2822.
  12. 12. Osheroff N (1989) Биохимические основы взаимодействия топоизомераз типа I и типа II с ДНК. Pharmacol Ther 41: 223–241.
  13. 13. Cortes Ledesma F, El Khamisy SF, Zuma MC, Osborn K, Caldecott KW (2009) Фосфодиэстераза 5′-тирозил ДНК человека, которая восстанавливает опосредованное топоизомеразой повреждение ДНК. Nature 461: 674–678.
  14. 14. Pouliot JJ, Yao KC, Robertson CA, Nash HA (1999) Дрожжевой ген для фосфодиэстеразы Tyr-ДНК, которая восстанавливает комплексы топоизомеразы I.Наука 286: 552–555.
  15. 15. Interthal H, Pouliot JJ, Champoux JJ (2001) Тирозил-ДНК-фосфодиэстераза Tdp1 является членом суперсемейства фосфолипаз D. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 12009–12014.
  16. 16. Ян С.В., Бургин А.Б. мл., Хьюзенга Б.Н., Робертсон К.А., Яо К.С. и др. (1996) Эукариотический фермент, который может разъединять тупиковые ковалентные комплексы между ДНК и топоизомеразами типа I. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 11534–11539.
  17. 17. Ambros V, Pettersson RF, Baltimore D (1978) Ферментативная активность в неинфицированных клетках, которая расщепляет связь между РНК полиовириона и 5′-концевым белком.Cell 15: 1439–1446.
  18. 18. Амброс В., Балтимор Д. (1980) Очистка и свойства клеточного фермента HeLa, способного удалять 5′-концевой белок из РНК полиовируса. J Biol Chem 255: 6739–6744.
  19. 19. Гулевич А.Ю., Юсупова Р.А., Дрыгин Ю.Ф. (2002) Унлинказа VPg, фосфодиэстераза, гидролизующая связь между VPg и РНК пикорнавируса: минимальный нуклеиновый фрагмент субстрата. Биохимия (Москва) 67: 615–621.
  20. 20. Шабанов А.А., Калюжный А.А., Готтих М.Б., Дрыгин Ю.Ф. (1996) Природные субстраты уридилилполинуклеотид- (5′P —> O) -тирозинфосфодиэстеразы — фермент, гидролизующий ковалентную связь между РНК и пикорнавирусом VPg и синтетическая модель их.Биохимия (Москва) 61: 794–803.
  21. 21. Дрыгин Ю.Ф., Шабанов А.А., Богданов А.А. (1988) Фермент, который специфически расщепляет ковалентную связь между пикорнавирусной РНК и VPg. FEBS Lett 239: 343–346.
  22. 22. Сангар Д.В., Брайант Дж., Харрис Т.Дж., Браун Ф., Роулендс Д.Д. (1981) Удаление связанного с геном белка вируса ящура лизатом ретикулоцитов кролика. J Virol 39: 67–74.
  23. 23. Ambros V, Baltimore D (1978). Белок связан с 5′-концом РНК полиовируса посредством фосфодиэфирной связи с тирозином.J Biol Chem 253: 5263–5266.
  24. 24. Дорнер А.Дж., Ротберг П.Г., Виммер Э. (1981) Судьба VPg во время трансляции РНК полиовируса in vitro. FEBS Lett 132: 219–223.
  25. 25. Дрыгин Ю. Ф., Сиянова Е. (1986) [Характеристики фермента, гидролизующего ковалентную связь между РНК и белком VPg вируса энцефаломиокардита]. Биохимия 51: 249–259.
  26. 26. Де Варенн А., Ломоносов Г.П., Шанкс М., Мауле А.Дж. (1986) Стабильность VPg вируса мозаики вигны в лизатах ретикулоцитов.J Gen Virol 67: 2347–2354.
  27. 27. Nomoto A, Lee YF, Wimmer E (1976) 5′-конец мРНК полиовируса не кэпирован m7G (5 ‘) ppp (5’) Np. Proc Natl Acad Sci U S A 73: 375–380.
  28. 28. Hewlett MJ, Rose JK, Baltimore D (1976) 5′-концевая структура полирибосомной РНК полиовируса — pUp. Proc Natl Acad Sci U S A 73: 327–330.
  29. 29. Pettersson RF, Flanegan JB, Rose JK, Baltimore D (1977) 5′-концевые нуклеотидные последовательности полирибосомной РНК вируса полиомиелита и РНК вириона идентичны.Природа 268: 270–272.
  30. 30. Fernandez-Munoz R, Darnell JE (1976) Структурные различия между 5′-концами вирусной и клеточной мРНК в инфицированных полиовирусом клетках: возможная основа для ингибирования синтеза белка хозяина. Дж. Вирол 18: 719–726.
  31. 31. Фернандес-Муньос Р., Лави У. (1977) 5′-концы РНК полиовируса: разница между вирионом и неинкапсидированной 35S РНК. Дж. Вирол 21: 820–824.
  32. 32. Baltimore D, Girard M, Darnell JE (1966) Аспекты синтеза РНК полиовируса и образования вирусных частиц.Вирусология 29: 179–189.
  33. 33. Puck TT, Marcus PI, Cieciura SJ (1956) Клональный рост клеток млекопитающих in vitro; характеристики роста колоний из одиночных клеток HeLa с питающим слоем и без него. J Exp Med 103: 273–283.
  34. 34. Lozzio CB, Lozzio BB (1973) Цитотоксичность фактора, выделенного из селезенки человека. J Natl Cancer Inst 50: 535–538.
  35. 35. Brodeur GM, Sekhon G, Goldstein MN (1977) Хромосомные аберрации в нейробластомах человека.Рак 40: 2256–2263.
  36. 36. Dildine SL, Semler BL (1992) Сохранение взаимодействий РНК-белок среди пикорнавирусов. J Virol 66: 4364–4376.
  37. 37. Walter BL, Parsley TB, Ehrenfeld E, Semler BL (2002) Определенные детерминанты домена KH связывающего поли (rC) белка для инициации трансляции полиовируса и репликации вирусной РНК. J Virol 76: 12008–12022.
  38. 38. Кун Р.Дж., Тада Х., Ипма-Вонг М.Ф., Данн Дж.Дж., Семлер Б.Л. и др. (1988) Создание «картриджа мутагенеза» для вирусного белка, связанного с геномом полиовируса: выделение и характеристика жизнеспособных и нежизнеспособных мутантов.Proc Natl Acad Sci U S A 85: 519–523.
  39. 39. Kuhn RJ, Tada H, Ypma-Wong MF, Semler BL, Wimmer E (1988) Мутационный анализ связанного с геномом белка VPg полиовируса. J Virol 62: 4207–4215.
  40. 40. Чейни И.В., Наим С., Шим Дж. Х., Рейнхардт М., Пай Б. и др. (2003) Жизнеспособность химерных вирусов VPg полиовируса / риновируса и идентификация аминокислотного остатка в гене VPg, важного для репликации вирусной РНК. J Virol 77: 7434–7443.
  41. 41.Doersen CJ, Stanbridge EJ (1979) Цитоплазматическое наследование устойчивости к эритромицину в клетках человека. Proc Natl Acad Sci U S A 76: 4549–4553.
  42. 42. Haller AA, Stewart SR, Semler BL (1996) Аттенуация повреждений стволовой петли в 5′-некодирующей области РНК полиовируса: дефекты трансляции, специфичные для нейронных клеток. J Virol 70: 1467–1474.
  43. 43. Brunner JE, Ertel KJ, Rozovics JM, Semler BL (2010) Замедленная кинетика синтеза РНК полиовируса в линии клеток человека с пониженными уровнями белков hnRNP C.Вирусология 400: 240–247.
  44. 44. Lloyd RE, Bovee M (1993) Постоянная инфекция эритробластоидных клеток человека полиовирусом. Вирусология 194: 200–209.
  45. 45. Adler SP, Purich D, Stadtman ER (1975) Каскадный контроль глутаминсинтетазы Escherichia coli. Свойства регуляторного белка PII и фермента, удаляющего уридилилтрансферазу. J Biol Chem 250: 6264–6272.
  46. 46. Арабшахи А., Броуди Р.С., Смоллвуд А., Цай Т.С., Фрей П.А. (1986) Галактозо-1-фосфатуридилилтрансфераза.Очистка фермента и стереохимический курс каждого шага механизма двойного смещения. Биохимия 25: 5583–5589.
  47. 47. Geeganage S, Frey PA (1998) Переходная кинетика образования и реакции уридилил-ферментной формы галактозо-1-P-уридилилтрансферазы и ее Q168R-варианта: понимание молекулярных основ галактоземии. Биохимия 37: 14500–14507.
  48. 48. Golini F, Semler BL, Dorner AJ, Wimmer E (1980) Связанная с белком РНК полиовируса способна образовывать комплекс инициации трансляции in vitro.Природа 287: 600–603.
  49. 49. Новак Дж. Э., Киркегаард К. (1994) Сцепление между трансляцией генома и репликацией в РНК-вирусе. Genes Dev 8: 1726–1737.
  50. 50. Nugent CI, Johnson KL, Sarnow P, Kirkegaard K (1999) Функциональная связь между репликацией и упаковкой РНК репликона полиовируса. J Virol 73: 427–435.
  51. 51. Дорнер А.Дж., Семлер Б.Л., Джексон Р.Дж., Ханекак Р., Дюпри Э. и др. (1984) Трансляция РНК полиовируса in vitro: использование внутренних сайтов инициации в лизате ретикулоцитов.J Virol 50: 507–514.
  52. 52. Калигуири Л.А., Compans RW (1973) Образование частиц полиовируса в ассоциации с комплексами репликации РНК. J Gen Virol 21: 99–108.
  53. 53. Pfister T, Pasamontes L, Troxler M, Egger D, Bienz K (1992) Иммуноцитохимическая локализация частиц, связанных с капсидом, в субклеточных фракциях клеток, инфицированных полиовирусом. Вирусология 188: 676–684.
  54. 54. Лю Ю., Ван С., Мюллер С., Пол А. В., Виммер Э. и др.(2010) Прямое взаимодействие между двумя вирусными белками, неструктурным белком 2CATPase и капсидным белком VP3, необходимо для морфогенеза энтеровируса. PLoS Pathog 6: e1001066.

границ | Вирус желтой мозаики ячменя VPg является детерминантным белком для нарушения eIF4E-опосредованной рецессивной устойчивости растений ячменя

Введение

Вирусные заболевания приводят к серьезным экономическим потерям из-за снижения качества и количества продукции растениеводства (Kang et al., 2005а). Селекция устойчивых сельскохозяйственных культур является наиболее приемлемым и применимым подходом к борьбе с вирусными заболеваниями, поскольку он экономически эффективен с точки зрения трудовых и материальных ресурсов и, что наиболее важно, не оказывает негативного воздействия на окружающую среду, за исключением применения строгих селективных методов. давление на популяции вирусов (Clay and Kover, 1996; Kang et al., 2005a; Zhu et al., 2012). Из всех известных резистентностей к вирусам растений большая часть наследуется рецессивно, при этом большая часть генов кодирует факторы инициации трансляции эукариот eIF4E, eIF4G или их изоформы (Fraile and García-Arenal, 2012; Wang and Krishnaswamy, 2012; Sanfaçon, 2015).

eIF4E-опосредованная резистентность культурных растений придает качественную, специфичную для генотипа устойчивость к вирусам рода Potyvirus семейства Potyviridae (Kyle and Palloix, 1997; Ruffel et al., 2002, 2005, 2006; Nicaise et al., al., 2003; Gao et al., 2004; Kang et al., 2005a; Bruun-Rasmussen et al., 2007; Roudet-Tavert et al., 2007; Charron et al., 2008; Andrade et al., 2009 ; Naderpour et al., 2010) и происходят за счет аминокислотных замен в белках eIF4E, кодируемых аллелями (Ruffel et al., 2006; Yeam et al., 2007). Временная экспрессия eIF4E из восприимчивых сортов делает устойчивые сорта восприимчивыми к определенному вирусному патотипу (Ruffel et al., 2002, 2006). eIF4E в эукариотических клетках является важным фактором инициации трансляции, который рекрутирует малую рибосомную субъединицу (40S) в структуру кэпа мРНК, событие, которое считается первым шагом в кэп-зависимой инициации трансляции (Malys and McCarthy, 2011). Более того, была выдвинута гипотеза, что eIF4E также играет множество ролей в различных процессах во время инфекции потивирусом, включая трансляцию, репликацию и перемещение от клетки к клетке (Robaglia and Caranta, 2006; Truniger and Aranda, 2009).Однако точные роли eIF4E во время вирусной инфекции еще предстоит продемонстрировать.

Вирусы семейства Potyviridae содержат одно- или двудольный (в роду Bymovirus ) положительно-смысловой геном РНК, который имеет связанный с геном вирусный белок (VPg) на 5′-конце и полиаденилированный на 3′-конце. конец (Адамс и др., 2012). Геном кодирует один или два полипротеина, которые продуцируют 10 зрелых белков самокодирующимися протеиназами и белком P3N-PIPO (довольно интересный Potyviridae ORF), продуктом сдвига рамки считывания из P3 (третьего белка) посредством проскальзывания полимеразы (Adams et al., 2005, 2012; Чунг и др., 2008; Olspert et al., 2015; Rodamilans et al., 2015). eIF4E-опосредованная устойчивость против потивирусов в значительной степени преодолевается вирусным VPg (Truniger and Aranda, 2009) и, в меньшей степени, P1 (первый белок / протеаза; Nakahara et al., 2010), P3 (Hjulsager et al., 2006) , CI (цитоплазматический белок включения; Abdul-Razzak et al., 2009; Tavert-Roudet et al., 2012) и, вероятно, HC-Pro (протеаза вспомогательного компонента; Ala-Poikela et al., 2011). Взаимодействие между eIF4E и VPg-хозяином необходимо для вирусной инфекции, и взаимодействие между этими двумя белками было показано для нескольких потивирусов (Léonard et al., 2000; Шаад и др., 2000; Канг и др., 2005b; Beauchemin et al., 2007; Roudet-Tavert et al., 2007; Йем и др., 2007; Charron et al., 2008; Gallois et al., 2010; Mazier et al., 2011; Эстеван и др., 2014).

Вирус желтой мозаики ячменя (BaYMV), который принадлежит к роду Bymovirus в семействе Potyviridae , является одним из двух возбудителей [другой — вирус мягкой мозаики ячменя (BaMMV)] экономически важной болезни желтой мозаики. ячменя озимого ( Hordeum vulgare L.) в Европе и Восточной Азии. В дополнение к их двудольному геному РНК, еще одной особенностью бимовирусов, которая отличает их от представителей других родов семейства Potyviridae , является их передача в почве с помощью корневого вектора Polymyxa graminis Ledingham, плазмодиофорного паразита (Adams et al. др., 2012; Тамада, Кондо, 2013). Подобно другим вирусным заболеваниям, передаваемым плазмодиофоридами, посадка устойчивых к вирусу сортов является распространенным способом борьбы с болезнями желтой мозаики (Ordon et al., 2009). В настоящее время в ячмене идентифицировано 18 генов устойчивости (15 рецессивных генов rym и три доминантных гена Rym ) против BaYMV (а также BaMMV), из которых rym4, rym5 и rym6 ( rym4 / 5 / 6 ) распознаются как аллельные гены, кодирующие eIF4E в области хромосомы 3H ячменя (Kanyuka et al., 2005; Stein et al., 2005). Появление вирулентного бимовируса у устойчивых сортов ячменя (в основном у сортов-носителей rym4 / 5 / 6 ) потенциально создает серьезную угрозу для производства ячменя (Kühne, 2009).Ген устойчивости rym5 , который первоначально использовался в программах селекции японского ячменя (Kobayashi et al., 1987; Konishi and Kaiser, 1991), был преодолен изолятом, разрушающим устойчивость (Kashiwazaki et al., 1989). Более того, резистентность, опосредованная rym6 , также была преодолена этим или другими вирулентными изолятами (Sotome et al., 2010; You and Shirako, 2013). Точно так же гены rym4 и, совсем недавно, rym5 , которые являются основным источником устойчивости сортов ячменя в европейских странах, были преодолены вирулентными изолятами BaYMV и BaMMV (Hariri et al., 2003; Habekuss et al., 2008; Кюне, 2009). Путем сравнения последовательностей между изолятами, разрушающими резистентность, и изолятами, не разрушающими резистентность, предполагается, что VPg является детерминантой вирусного белка, ответственного за нарушение опосредованной eIF4E устойчивости ячменя (Kühne et al., 2003; Kanyuka et al., 2004; Habekuss et al. ., 2008; Nishigawa et al., 2008). Кроме того, как вирусный VPg, так и eIF4E-хозяин участвуют в тропизме бимовирусов клетками-хозяевами (ячмень или пшеница) (Li and Shirako, 2015).

В этом исследовании мы использовали инфекционные клоны кДНК, полученные из разрушающих устойчивость и не нарушающих устойчивость изолятов BaYMV, для исследования механизмов, лежащих в основе rym4 / 5 / 6 eIF4E-опосредованной устойчивости растений ячменя.Наши результаты идентифицировали VPg как детерминантный белок для разрушения резистентности rym4 / 5 / 6 . Более того, мутационные анализы в сочетании с анализами инокуляции протопластов и цельного растения предполагают, что генетическая совместимость между кодируемым вирусом VPg и хозяином eIF4E регулирует инфекцию BaYMV как на внутриклеточном, так и на межклеточном уровне (от клетки к клетке и / или перемещения на большие расстояния).

Материалы и методы

Растения

семян Риофу были приобретены в местном филиале Японского сельскохозяйственного кооператива.Семена экспресс-ячменя (несущие rym4 ) и Maris Otter были получены из Института эпидемиологии и диагностики патогенов, Германия. Другой ячмень (содержащий rym5 : Mikamo Golden, Misato Golden; несущий rym6 : Haruna Nijo, Amagi Nijo и Miho Golden; KoA) семена были получены из Института растениеводства и ресурсов Университета Окаяма при частичной поддержке Национальным проектом биоресурсов Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий (MEXT) Японии.

Очистка вирусов и определение последовательности

вирионов BaYMV очищали из 2 г инфицированных листьев с помощью процедуры, описанной ранее (Shirako and Brakke, 1984), и суспендировали в не содержащей РНКаз H 2 O. Суспензию вируса обрабатывали протеиназой K при 37 ° C в течение 30 мин. и вирусную РНК экстрагировали для синтеза кДНК. КДНК первой цепи синтезировали с использованием обратной транскриптазы PrimeScript ® (Takara Bio, Япония), а затем амплифицировали путем перекрывающейся ОТ-ПЦР с использованием ДНК-полимеразы PrimeSTAR ® HS (Takara Bio, Япония).Все продукты амплификации очищали с использованием набора FastGene TM Gel / PCR Extraction Kit (Nippon Genetics, Япония), а затем напрямую отправляли в коммерческую службу секвенирования (Eurofins Operon, Япония).

Конструирование полноразмерных клонов кДНК BaYMV Tochigi Isolate JT10 RNA1 and RNA2

Мы выделили изолят BaYMV, разрушающий rym5 (названный изолятом JT10), из пораженных листьев сорта ячменя, несущего rym5 (Mikamo Golden), в префектуре Точиги, Япония, в 2010 г. (Shirako and Li, неопубликованные данные).Конструирование инфекционных полноразмерных клонов кДНК изолята Tochigi JT10 RNA1 (кодирующего полипротеин 1, P1) и РНК2 (кодирующего полипротеин 2, P2) выполняли, как описано для изолята Kurashiki JK05 (You and Shirako, 2010). Для создания полноразмерного клона кДНК JT10 РНК1, названного pBY-JT1, мы выполнили ОТ-ПЦР с использованием праймера TB162 для синтеза первой цепи кДНК и праймеров TB87 и TB162 для процедуры ПЦР. Амплифицированный продукт размером 7,8 т.п.н. очищали и расщепляли с помощью Xba I и Bam HI, а затем клонировали в сайты Xba I– Bam HI, модифицированные из конструкции pBY-JK1 (You and Shirako, 2010; рисунок). 1А).Для конструирования клона кДНК РНК2, названного pBY-JT2, мы выполнили ОТ-ПЦР с использованием праймера TB166 для синтеза первой цепи кДНК и праймеров TB163 и TB166 для амплификации ПЦР. Очищенный продукт ПЦР размером 3,7 т.п.н. расщепляли с помощью Bam HI и Spe I, а затем клонировали в сайты Bam HI– Spe I конструкции pBY-JK2 (You and Shirako, 2010; Рисунок 1A) . Обе процедуры рекомбинантной ДНК проводили стандартными методами с использованием штамма Escherichia coli MC1061, и клоны проверяли путем секвенирования плазмидных вставок.Все праймеры, используемые для клонирования, перечислены в дополнительной таблице S1.

РИСУНОК 1. Инфекционная способность in vitro транскриптов, полученных из клонов кДНК JT10 вируса желтой мозаики ячменя. (A) Схематическое изображение полноразмерных клонов кДНК изолята JT10 ( rym5, -разрыв) (pBY-JT1 и pBY-JT2) и изолята JK05 ( rym5 -неразрывный) изолята (pBY-JK1 и pBY- JK2). pBY-JT2.GFP и pBY-JK2.GFP представляют собой конструкции РНК2, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), полученные путем замены кодирующих областей P1 и P2 геном GFP . (B) Вестерн-блот-анализ накопления белка оболочки (CP) в чувствительных протопластах и ​​протопластах rym5 , трансфицированных транскриптами JT10 in vitro . Большие субъединицы rubisco окрашивали кумасси бриллиантовым синим G-250 и использовали в качестве контроля загрузки. (C) Флуоресценция GFP в чувствительных и rym5 протопластах , трансфицированных in vitro транскриптами JT10 или JK05 РНК1 (pBY-JT1 или pBY-JK1) и GFP-экспрессирующей РНК2 (pBY-JT2.-GFP2 или pBY-JT2.-GFP2 .GFP). Прутки, 200 мкм. (D) Вирусные симптомы в верхних системных листьях растений rym5 после инокуляции JT10 in vitro транскриптами . л.с., часы после инокуляции; w.p.i., недели после инокуляции.

Инокуляция протопластов и листьев

транскриптами in vitro

РНК-транскриптов были синтезированы in vitro и из линеаризованных плазмид, как описано ранее (Yamamiya and Shirako, 2000). Протопласты мезофилла получали из 7-дневных проростков ячменя в соответствии с процедурами, описанными ранее (Ohsato et al., 2003; Ли и Ширако, 2015). Приблизительно 5 × 10 5 клеток трансфицировали in vitro транскриптами BaYMV РНК1 и РНК2 (по 4 мкл транскриптов каждого) и затем инкубировали при 15 ° C в течение 66 часов в темноте.

Инокуляции растений ячменя транскриптами in vitro проводили, как описано ранее (Li and Shirako, 2015). В каждом эксперименте инокулировали от трех до семи проростков со стадиями от двух до трех листьев. Инокулированные растения содержали в камере для выращивания при 15 ° C и освещении в течение 16 часов.

Конструирование химер РНК1

Для анализа картирования вирусных детерминант для преодоления устойчивости к rym5 было сконструировано восемь химерных инфекционных клонов кДНК для анализа инфекционности: pBY-JK1.JT-XbNs [5 ‘нетранслируемая область (UTR) — Nsi I область из pBY- JT1], pBY-JK1.JT-MsNd ( Msc I– Nde I область из pBY-JT1), pBY-JK1.JT-XbKp (5 ‘UTR– Kpn I область из pBY-JT1), pBY-JK1.JT-NsNd ( Nsi, I – NdeI область из pBY-JT1), pBY-JK1.JT-KpN ( Kpn I– Nsi I область из pBY-JT1), pBY-JK1.JT-KpMs ( Kpn I– Msc I область из pBY-JT1), pBY-JK1.JT- MsNs ( Msc I– Nsi I область из pBY-JT1) и pBY-JK1.JT-VPg (кодирующая область VPg из pBY-JT1; Рисунок 2B). Эти конструкции были созданы путем замены областей изолята Kurashiki JK05 соответствующими областями изолята Tochigi JT10. Для создания pBY-JK1.JT-VPg ПЦР проводили в присутствии pBY-JK1 и pBY-JT1 в качестве шаблонов.Полученные продукты ПЦР очищали, и они служили в качестве смешанной матрицы для создания фрагмента, содержащего ген VPg из изолята Tochigi JT10 на фоне изолята Kurashiki JK05. Конечные амплифицированные фрагменты очищали и клонировали в pBY-JK1 с сайтами Afl II и Sal I с использованием набора CE для системы In-Fusion HD Cloning System (Clontech Laboratories, США). Праймеры, используемые для этой конструкции, перечислены в дополнительной таблице S1. Для создания файла pBY-JK1.Конструкция JT-MsNs, фрагмент Msc I– Nsi I был высвобожден из pBY-JT1 и лигирован в аналогичным образом расщепленную pBY-JK1. Для создания конструкции pBY-JK1.JT-KpNs фрагмент Kpn I– Nsi I был высвобожден из pBY-JT1 и лигирован в аналогичным образом расщепленный pBY-JK1. Для создания конструкции pBY-JK1.JT-XbNs фрагмент Xba I– Nsi I был высвобожден из pBY-JT1 и лигирован в аналогичным образом расщепленный pBY-JK1. Для создания конструкции pBY-JK1.JT-MsNd фрагмент Msc I– Nde I был высвобожден из pBY-JT1 и лигирован в аналогичным образом расщепленный pBY-JK1.Для создания конструкции pBY-JK1.JT-KpMs фрагмент Kpn I– Msc I был высвобожден из pBY-JT1 и лигирован в аналогичным образом расщепленный pBY-JK1. Для создания конструкции pBY-JK1.JT-XbKp фрагмент Xba I– Kpn I был высвобожден из pBY-JT1 и лигирован в аналогично расщепленный pBY-JK1. Для создания конструкции pBY-JK1.JT-NsNd фрагмент Nsi I– Nde I был высвобожден из pBY-JT1 и лигирован в аналогичным образом расщепленный pBY-JK1.

РИСУНОК 2. Вирус желтой мозаики ячменя (BaYMV) VPg отвечает за разрушение устойчивости растений ячменя rym5 . (A) Схематическое изображение клонов кДНК РНК1, pBY-JT1 (JT10) и pBY-JK1 (JK05). Положения аминокислотных различий между изолятом Tochigi JT10 ( rym5 -разрыв) и изолятом Kurashiki JK05 ( rym5 -неразрывный) обозначены вертикальными красными линиями. Вертикальная синяя линия указывает положение одной аминокислотной разницы в белке PIPO.( (B) Схематическое изображение клонов химерной кДНК между pBY-JT1 (JT10) и pBY-JK1 (JK05). Показаны уникальные сайты рестрикции для конструирования химер. (C) Накопление белка оболочки (CP) BaYMV относительно к накоплению CP вируса JT10 дикого типа в протопластах rym5 , трансфицированных химерными транскриптами РНК1 в дополнение к транскриптам РНК2 дикого типа (BY-JK2 или BY-JT2). (D) Схематическое изображение, показывающее аминокислотные различия между JT10 VPg и JK05 VPg.Аминокислотные замены в каждом VPg указаны стрелками. (E) Относительное накопление CP изолята JT10 или JK05, имеющего аминокислотную мутацию в VPg, в протопластах rym5 . Общее количество CP-положительных растений в верхних листьях / общее количество инокулированных растений и процент от общего числа растений, показавших системную вирусную инфекцию, представлены под графиком. nd, не определено. Накопление CP в трансфицированных протопластах или верхних системных листьях инокулированных растений обнаруживали с помощью вестерн-блоттинга (C, E) .Все значения на гистограммах представляют собой средние значения со стандартным отклонением (SD) из трех независимых экспериментов. Образцы из протопластов rym5 , инокулированных JT10, использовали в качестве эталона, и относительные средние значения мутантов вируса были откалиброваны относительно эталонных значений.

pBY-JK1.JG-VPg, pBY-JK1.Y1A-VPg и pBY-JK1.Y2A-VPg были сконструированы аналогично pBY-JK1.JT-VPg. Все процедуры рекомбинантной ДНК проводили стандартными методами с использованием штамма E. coli MC1061, и клоны проверяли секвенированием плазмидных вставок.

Конструирование мутантов РНК2

GFP (зеленый флуоресцентный белок) -экспрессирующий мутант РНК2 pBY-JT2.GFP (рис. 1A) был получен из pBY-JT2 таким же образом, как замена pBY-JK2.GFP кодирующих областей P1 и P2 между 5′- и 3′-UTRs РНК2 с геном GFP (You and Shirako, 2010). Праймеры, используемые для строительства, перечислены в дополнительной таблице S1.

Два мутанта eIF4E-экспрессирующей РНК2, pBY-JK2.P12 / KoA_eIF4E (NIb / CP) и pBY-JK2.P12 / KoA_eIF4E (P1 / P2), были сконструированы и использованы в этом исследовании (рис. 4A).ПЦР проводили в присутствии pBY-JK2 и гена KoA eIF4E в качестве отдельных матриц (Li and Shirako, 2015). Полученные продукты ПЦР очищали, и они служили смешанной матрицей для создания окончательных ожидаемых фрагментов. Затем фрагменты переваривали и лигировали в pBY-JK2. Все процедуры рекомбинантной ДНК проводили стандартными методами с использованием штамма E. coli MC1061, и клоны проверяли секвенированием плазмидных вставок. Праймеры, используемые для каждой конструкции, перечислены в дополнительной таблице S1.

Производство антисыворотки P2 и eIF4E

Белки

BaYMV P2 и eIF4E ячменя получали путем слияния белков с глутатион-трансферазой S (GST) в клетках E. coli (штамм MC1061), как описано You and Shirako (2010). Одного кролика иммунизировали 2 мг каждого очищенного рекомбинантного слитого белка (GST: P2 и GST: eIF4E).

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее (Yamaguchi and Shirako, 2002).В качестве первичных антител использовали поликлональные антитела против BaYMV CP (белок оболочки), P2 и eIF4E ячменя. Каждый тест на прививку вируса на протопластах или целых растениях повторяли как минимум трижды, за исключением инокуляции мутантов BY-JK1.Y1A-VPg и Y2A-VPg, которые были продублированы в протопластах rym4 , и инокуляции BY-JK1, BY-JK1. .Y1A-VPg, Y2A-VPg и JG-VPg мутанты, которые были выполнены только один или два раза на rym4 и rym6 растениях (рис. 3). Положительные (BaYMV-инфицированные восприимчивые растения) и отрицательные (имитирующие растения) контрольные образцы всегда включали в каждый блот.

РИСУНОК 3. Вирус желтой мозаики ячменя (BaYMV) VPg отвечает за разрушение резистентностей rym4 и rym6 . (A, B) Относительное накопление белка оболочки (CP) BaYMV изолята JK05 с заменой VPg в rym4 (A) и rym6 (B) . Все значения на гистограммах представляют собой средние значения со стандартным отклонением от двух или трех независимых экспериментов. Образцы протопластов Ryofu, инокулированные JK05, использовали в качестве эталона.

Для количественной оценки уровней накопления CP в протопластах полосы CP на всех блотах сканировали с использованием программного обеспечения ImageJ 1.42q (Национальный институт здоровья Уэйна Расбанда, США). Интенсивность полосы CP каждого образца была нормализована с интенсивностью полосы большой субъединицы rubisco соответствующего образца, а относительные средние баллы были откалиброваны относительно баллов положительного контроля, как описано ранее (You and Shirako, 2013).

Моделирование гомологии белков ячменя eIF4E

Аминокислотная последовательность KoA eIF4E ячменя была отправлена ​​на сервер моделирования гомологии SWISS-MODEL (Arnold et al., 2006; Biasini et al., 2014). Построение трехмерной структуры этого белка было основано на гомологии последовательности с eIF4E пшеницы (код PDB: 2idr). Предсказанная структура была визуализирована с помощью программного обеспечения Deep View / Swiss-PdbViewer v4.1.0 (Johansson et al., 2012).

Результаты

Конструирование инфекционного клона кДНК из

rym5 -разрушающего изолята BaYMV

Полноразмерные нуклеотидные последовательности РНК1 и РНК2 BaYMV JT10 ( rym5 -разрушающий изолят) были определены и депонированы в базе данных GenBank с номерами доступа AB920780 для РНК1 (7642 нуклеотида) и AB920781 для РНК2 (3585 нуклеотидов).Клоны полноразмерной кДНК JT10 были сконструированы и названы pBY-JT1 и pBY-JT2 (рис. 1A) для РНК1 и РНК2 соответственно. Репликативную способность транскриптов РНК JT10 (BY-JT1 RNA1 и BY-JT2 RNA2) из ​​двух клонов исследовали в протопластах, выделенных из сортов ячменя, несущих rym5 (Mikamo Golden и Misato Golden). Протопласты, выделенные из сорта ячменя Риофу, использовали в качестве чувствительного контроля. Протопласты трансфицировали транскриптами JT10, а затем инкубировали при 15 ° C в течение 66 часов в темноте.После инкубации протопласты собирали и подвергали Вестерн-блоттингу с использованием антисыворотки против CP (You and Shirako, 2010). Накопления CP были обнаружены во всех протестированных протопластах (рис. 1B), что указывает на размножение вируса. Чтобы визуально контролировать вирусную инфекцию в протопластах, кодирующая область полипротеина P1 – P2 в pBY-JT2 была заменена на последовательность, кодирующую ген GFP (pBY-JT2.GFP; Рисунок 1A). Флуоресценция GFP наблюдалась как в чувствительных протопластах, так и в протопластах rym5 , трансфицированных BY-JT1 РНК1 + BY-JT2.GFP RNA2, но не в протопластах rym5 и , трансфицированных BY-JK1 RNA1 + BY-JK2.GFP RNA2 (рис. 1C), что подтверждает инфекционную природу транскриптов.

Затем была исследована системная инфекционность РНК1 и РНК2 JT10 на уровне всего растения посредством ручной инокуляции. Симптомы появления желтых мозаичных листьев наблюдались у восприимчивых растений (сорт Ryofu) и rym5 (сорта Mikamo Golden и Misato Golden) через 5–7 недель после инокуляции (w.p.i .; Рисунок 1D и данные не показаны).ОТ-ПЦР / анализ секвенирования потомков вируса подтвердил, что транскрипты JT10 были системно инфекционными для сортов rym5 (данные не показаны). Для сравнения, у растений сорта Ryofu, инокулированных транскриптами РНК JK05 (BY-JK1 RNA1 и BY-JK2 RNA2 из нерасщепляющегося изолята BaYMV rym5 ; You and Shirako, 2013), симптомы желтой мозаики развивались на 3-5 недель быстрее, чем инокулированные вирусом JT10 (данные не показаны).

VPg — определяющий вирусный белок для разрушения устойчивости

rym5

Предыдущие исследования показали, что BaYMV RNA1, которая кодирует набор белков, включая РНК-полимеразу, может автономно реплицироваться в протопластах ячменя, в то время как РНК2 нужна РНК1 для репликации (You and Shirako, 2010; Li and Shirako, 2015).Таким образом, мы предположили, что BaYMV RNA1 кодирует наиболее важный фактор (факторы), ответственный за нарушение eIF4E-опосредованной ( rym5 ) устойчивости. Кроме того, поскольку замена кодирующей области в РНК2 геном GFP (рис. 1A) не влияет на способность JT10 размножаться в протопластах rym5 (рис. 1C), вирусный фактор (ы), ответственный за нарушение устойчивости к rym5 , таким образом скорее всего, находятся в BaYMV RNA1. Сравнение последовательностей показало, что в пределах РНК1 изолят JT10 имеет 29 аминокислотных отличий от rym5 -неразрушающего изолята JK05 (You and Shirako, 2013).Примечательно, что аминокислотные замены присутствовали почти во всех кодирующих белках, за исключением CP (рис. 2A).

Для идентификации вирусного фактора (ов), участвующих в нарушении устойчивости rym5 , частичные фрагменты ДНК, полученные из pBY-JT1, были использованы для замены соответствующих последовательностей в клоне кДНК, полученном из JK05 RNA1, который был создан ранее (You and Shirako, 2010 ; здесь переименованы в pBY-JK1 и pBY-JK2 для клонов, производных от РНК1 и РНК2, соответственно). Семь химер были сконструированы с использованием доступных уникальных сайтов рестрикционных ферментов (рис. 2В).Протопласты листьев, выделенные из растений сорта Misato Golden ( rym5 ), трансфицировали смесями in vitro транскриптов , синтезированных с использованием химер на основе pBY-JK1 и pBY-JK2. Вестерн-блоттинг показал, что четыре химерных вируса (BY-JK1.JT-XbNs, BY-JK1.JT-MsNd, BY-JK1.JT-KpNs и BY-JK1.JT-MsNs) способны накапливаться в протопластах rym5 , хотя уровень BY-JK1.JT-MsNs был ниже, чем у других мутантов, вероятно, из-за ингибирующего действия химерной последовательности на накопление вируса (рис. 2С).Эти инфекционные транскрипты аналогичным образом содержали центральную область генома JT10, которая кодирует 6K2 (белок 2 6 кДа), VPg и NIa (ядерное включение протеиназы; рис. 2В). Когда только часть VPg генома JT10 использовалась для замены соответствующей области в pBY-JK1, химерные транскрипты (BY-JK1.JT-VPg) были инфекционными в протопластах rym5 (рис. 2C), а также в целых растениях, при котором проявился легкий мозаичный симптом, а скопления ЦП были обнаружены в верхних системных листьях через 4 недели.Пи. (Рисунок 2E; данные не показаны). Эти наблюдения подтверждают, что VPg ответственен за нарушение опосредованной eIF4E устойчивости растений ячменя.

Ser-118, Thr-120 и His-142 из VPg имеют решающее значение для преодоления сопротивления

rym5 Выравнивание последовательностей

показало, что шесть аминокислотных остатков в положениях 73, 85, 118, 120, 142 и 175 в JT10 VPg отличаются от соответствующих остатков в JK05 VPg (фигура 2D; таблица 1). Чтобы точно определить, какие ключевые аминокислоты в VPg важны для нарушения устойчивости к rym5 , каждая из этих шести аминокислот в фоновом pBY-JT1 была заменена на те же остатки, которые кодируются в VPg JK05, а затем инфекционность каждого мутанта вируса (с присутствием JT1 RNA2) исследовали в протопластах rym5 и целых растениях (сорт Мисато Голден).Вестерн-блоттинг показал, что замена Ser-118 и His-142 на Thr (S118T) и Tyr (h242Y), соответственно, устраняет способность JT10 инфицировать протопласт rym5 , тогда как замена Thr-120 на Lys (T120K) в значительной степени снижает JT10. накопление в протопластах rym5 (рис. 2E). Напротив, мутации Phe-73, Glu-85 и Val-175 (F73Y, E85D и V175A, соответственно) не имели или частично влияли на накопление JT10 в протопластах rym5 (рис. 2E). Эти результаты показывают, что Ser-118 и His-142, а также Thr-120, в меньшей степени, имеют решающее значение для преодоления сопротивления rym5 , в то время как Phe-73, Glu-85 и Val-175 менее важны для разрушения. rym5 устойчивость на внутриклеточном уровне.Наши предварительные результаты показали, что мутанты JT10 с заменой Phe-73 или Glu-85 не вызывали каких-либо системных симптомов у растений rym5 (данные не показаны). Это может указывать на то, что эти остатки имеют решающее значение для вирусной системной инфекции всего растения.

ТАБЛИЦА 1. Аминокислотные различия белков VPg из изолятов вируса желтой мозаики ячменя (BaYMV) JK05, JT10, JG10, Y1A и Y2A.

В обратном эксперименте JK05 смог заразить rym5 протопластов только при одновременной замене Thr-118, Lys-120 и Tyr-142 (тройная мутация, T118S / K120T / Y142H), но не тогда, когда только Thr-118 и Одновременно были заменены Tyr-142 (двойная мутация, T118S / Y142H; фиг. 2E).Уровень накопления JK05 с тройными мутациями был низким в протопластах rym5 (рис. 2E), что согласуется с предыдущим наблюдением (с использованием JT10). Более того, JK05 с тройными мутациями не смог заразить все растения (рис. 2E) в соответствии с представлением о том, что два других аминокислотных остатка в положениях 73 и 85 в VPg могут быть важны для вирусной системной инфекции, хотя они частично важны для преодоления сопротивления на внутриклеточном уровне.

VPg также является определяющим белком, ответственным за нарушение резистентности

rym4 и rym6

Поскольку rym4 / 5 / 6 являются аллелями с аналогичными генами eIF4E (Kanyuka et al., 2005; Stein et al., 2005), возможно, что VPg также является детерминантным белком для разрушения rym4 и rym6 сопротивления . В Европе устойчивость rym4 широко использовалась для селекции ячменя в последние десятилетия (Kühne, 2009).Изоляты BaYMV из немецкого Y2A, но не Y1A, были способны инфицировать rym4 растений в полевых условиях (Kühne et al., 2003). Когда гены VPg , полученные из изолятов Y2A и Y1A, были использованы для замены гена VPg в pBY-JK1, JK05 Y2A-VPg, но не JK05 Y1A-VPg мог инфицировать rym4 протопластов и растений (сорт Экспресс), тогда как оба химерные вирусы могут инфицировать чувствительные растения ячменя (сорт Maris Otter; рис. 3A). Изолят BaYMV JK05 мог накапливаться до низких уровней в протопластах rym6 (сорта Haruna Nijo, Amagi Nijo или Miho Golden), но не мог системно инфицировать растения rym6 (You and Shirako, 2013; Рисунок 3B).Изолят BaYMV JG10 представляет собой изолят, разрушающий rym6 , из растений rym6 (сорт Haruna Nijo) в Гумме, Япония, в 2010 г. (см. Таблицу 1 для его аминокислотной последовательности VPg; Shirako and Li, неопубликованные данные). JK05 JG10-VPg накапливался до высоких уровней в протопластах rym6 и системно инфицировал все три разновидности, несущие rym6 (рис. 3B). Взятые вместе, BaYMV VPg также является детерминантным белком для нарушения устойчивости rym4 и rym6 .

Экспрессия гена

eIF4E , полученного из восприимчивого сорта ячменя, делает возможным размножение JK05 в протопластах rym5

Учитывая, что совместимость между VPg и хозяином eIF4E играет важную роль в определении способности BaYMV инфицировать растения ячменя, мы ожидали, что экспрессия гена eIF4E , полученного из восприимчивого сорта ячменя, может способствовать накоплению неразрушающих изолятов в rym5 протопластов.С этой целью ген eIF4E , полученный из восприимчивого сорта КоА (KoA eIF4E), был вставлен в JK05 РНК2 (pBY-JK2) ниже гена P2 с добавлением протеазы NIb / CP или P1 / P2. сайт расщепления для высвобождения eIF4E из полипротеина или для экспрессии продукта слияния P2 (протеиназа P1, скорее всего, действует только в cis ; Фигуры 4A, B). Протопласты восприимчивых (сорт Ryofu) и rym5 (сорт Misato Golden) растений трансфицировали транскриптами JK05 РНК1 и eIF4E-экспрессирующей РНК2.Как и ожидалось, накопления CP были обнаружены в протопластах rym5 после трансфекции транскриптами JK05 RNA1 + JK05 RNA2 KoA_eIF4E (NIb / CP) или + JK05 RNA2 KoA_eIF4E (P1 / P2) (рис. 4C). Накопления CP этих вирусов, экспрессирующих KoA_eIF4E, в протопластах rym5 были не так многочисленны, как в чувствительных протопластах, но были довольно сопоставимы с накоплениями JT10 в протопластах rym5 (рис. 4C). Эти результаты продемонстрировали, что экспрессия KoA eIF4E из вирусного генома в некоторой степени может способствовать накоплению несовместимого JK05 ( rym5 -нормальный изолят) в протопластах rym5 .Обратите внимание, что хотя оба транскрипта, несущие KoA eIF4E, были инфекционными в протопластах rym5 , как и ожидалось, свободный eIF4E (~ 24 кДа) эффективно высвобождался NIb / CP, но не сайтами расщепления P1 / P2 (рис. 4D). Таким образом, eIF4E также может быть функциональным в форме слитого белка P2-eIF4E (~ 94 кДа). Тем не менее, экспрессия KoA eIF4E из вирусного генома не позволила инфицировать JK05 целые растения (фиг. 4C), что указывает на то, что некоторые другие факторы устойчивости должны быть задействованы в rym5 растениях.

РИСУНОК 4. Экспрессия eIF4E из вирусного генома. (A) Схематическое изображение конструкций JK05 RNA2, экспрессирующих eIF4E. (B) Схематическое изображение, показывающее основные аминокислотные различия между аллелями KoA (чувствительный) и rym5 (резистентность) eIF4E. Аминокислотные замены в каждом eIF4E указаны стрелками. (C, E) Накопление белка оболочки (CP) вируса желтой мозаики ячменя (BaYMV) в чувствительных протопластах и ​​протопластах rym5 , трансфицированных экспрессирующими eIF4E транскриптами JK05 RNA2 (BY-JK2) в дополнение к JK05 RNA1 (BY-JK1) стенограммы.Все значения на гистограммах представляют собой средние значения со стандартным отклонением от трех независимых экспериментов. Образцы из протопластов Ryofu или rym5 , инокулированные JK05 (C) или JT10 (E) , использовали в качестве эталона. (D) Вестерн-блот-анализ накопления eIF4E и BaYMV P2 ячменя в протопластах сорта Ryofu (чувствительный), трансфицированных транскриптами JK05 RNA2 (BY-JK2), экспрессирующими eIF4E, плюс транскриптами JK05 RNA1 (BY-JK1). Красными звездочками отмечены полосы слияний eIF4E и P2: eIF4E на блотах.

Выравнивание последовательностей

показало, что три аминокислотных остатка в положениях 120 (Thr), 160 (Asn) и 161 (Gln) в eIF4E из сортов, несущих rym5 , отличаются от соответствующих остатков в eIF4E из восприимчивых сортов (рис. 4E). ; Таблица 2). Замена Asn-160 и Gln-161 на Asp и Lys (N160D и Q161K), соответственно, отменила активность KoA eIF4E, чтобы облегчить инфекцию JK05 в протопластах rym5 (сорт Misato Golden), в то время как замена Thr-120 на Ser ( T120S) только уменьшил накопление вируса (рис. 4E).Тем не менее, замены либо Asp-160 на Asn (D160N), либо Lys-161 на Gln (K161Q) в rym5 eIF4E были недостаточными для обеспечения накопления JK05 в протопластах rym5 (Рисунок 4E). Таким образом, одновременное присутствие как Asn-160, так и Gln-161 в rym5 eIF4E может быть необходимо для облегчения инфекции BaYMV.

ТАБЛИЦА 2. Аминокислотные различия белков eIF4E из нескольких сортов ячменя, несущих разные аллели устойчивости.

Обсуждение

В настоящем исследовании вирусный фактор (ы), ответственный за нарушение устойчивости к rym5 , был идентифицирован с помощью анализа геномного картирования с использованием инфекционных клонов кДНК, полученных из BaYMV JK05 ( rym5 -неразрывный) и JT10 ( rym5 -разрушающий) изоляты (рисунки 1 и 2). Наряду с присутствием JK05 RNA2, химера JK05 RNA1 (BY-JK1.JT-VPg) с геном JK05 VPg , замененным геном изолята JT10, накапливалась в протопластах rym5 и была инфекционной для растений rym5 в на уровне всего растения (рис. 2).Аналогичным образом, химеры РНК1 VPg с геном JK05 VPg заменены на химеры rym4 и rym6 изолятов, разрушающих устойчивость (Y2A и JG), каждая из которых индивидуально нарушает соответствующую устойчивость на уровне всего растения (рис. в таблице 3). Таким образом, BaYMV VPg является детерминантным белком, ответственным за нарушение опосредованной eIF4E устойчивости rym4 / 5 / 6 растений ячменя. Кроме того, мы попытались точно идентифицировать ключевую аминокислоту (аминокислоты) VPg, необходимую для преодоления этих опосредованных eIF4E сопротивлений.Замены по крайней мере трех аминокислот в положениях 118, 120 и 142 в VPg rym5 -неразрушающего изолята JK05 необходимы для преодоления устойчивости протопластов к rym5 , но их было недостаточно для установления вирусной системная инфекция у растений rym5 (рис. 2). Эти результаты показывают, что мутации многочисленных аминокислотных остатков в VPg необходимы для полного разрушения eIF4E-опосредованной устойчивости растений ячменя. VPg обладает некоторыми типичными чертами белков с внутренней неупорядоченностью и, как известно, связан с геномом некоторых вирусов растений с положительной РНК (например,g., представители семейств Potyviridae и Secoviridae и родов Sobemovirus, Polerovirus и Enamovirus ) и позвоночных (например, представители семейств Picornaviridae и Caliciviridae ; Jiang и Lalibertidae, 2011 г. ). В потивирусах VPg является белком-концентратором, который взаимодействует с несколькими белками как вирусного происхождения, так и хозяина, вероятно, включая eIF4E (см. Ниже), и, по-видимому, участвует в различных вирусных процессах, таких как трансляция, репликация, межклеточная и / или перемещение на большие расстояния (Jiang and Laliberté, 2011; Revers and García, 2015).

ТАБЛИЦА 3. Сводка по накоплению и системной инфекционности мутантов VPg вируса желтой мозаики ячменя (BaYMV) в протопластах или растениях rym4 / 5/6 .

Роль eIF4E ячменя во время инфекции BaYMV исследовали по экспрессии eIF4E хозяина из РНК вирусного генома. Когда eIF4E, полученный из восприимчивого сорта, экспрессировался из JK05 RNA2, накопление CP было обнаружено с помощью вестерн-блот-анализа (рис. 4), демонстрируя, что присутствие совместимого eIF4E делает возможным размножение нерасщепляющегося изолята BaYMV rym5 в rym5 сот.В случае потивирусов было показано, что eIF4E-хозяин влияет на вирусную инфекцию, но нет прямых доказательств, демонстрирующих функцию eIF4E в размножении вирусов на внутриклеточном уровне (Schaad et al., 2000; Gao et al., 2004). Наше исследование предоставило экспериментальные доказательства, показывающие функции хозяина eIF4E в размножении растительных вирусов на внутриклеточном уровне, хотя остается неясным, как eIF4E участвует в этом процессе. Современные модели роли eIF4E в потивирусной инфекции на внутриклеточном уровне предполагают, что eIF4E действует согласованно с VPg и другими вирусными (такими как P1 и HC-Pro) и факторами хозяина [такими как eIF4G и поли (A) -связывающий белок] факторами. для облегчения репликации вирусного генома, трансляции и / или защиты трансляции / репликации вируса (Wang and Krishnaswamy, 2012; Mäkinen and Hafrén, 2014).Кроме того, предполагается, что eIF4E участвует в потивирусном внутриклеточном перемещении, перемещении от клетки к клетке (или на большие расстояния) посредством взаимодействия с VPg, белком CI и eIF4G (Wang and Krishnaswamy, 2012; Mäkinen and Hafrén, 2014) . Интересно, что наши результаты предполагают, что eIF4E ячменя также играет роль (и) в перемещении BaYMV от клетки к клетке и / или в системном накоплении вируса, потому что замены связанных с размножением аминокислот в VPg из неразрушающего изолята были недостаточными. для разрушения опосредованной eIF4E устойчивости ячменя на уровне всего растения (рис. 2).Поскольку развитие инфекции BaYMV у растений ячменя происходит довольно медленно, трудно наблюдать процессы перемещения от клетки к клетке, такие как те, которые наблюдаются для вируса мозаики, переносимого семенами гороха (PSbMV, potyvirus), в растениях гороха (Gao et al. , 2004).

Наше исследование показывает, что совместимость между белками VPg и eIF4E необходима для размножения вируса (и перемещения вируса от клетки к клетке), предполагая, что между eIF4E ячменя и VPg BaYMV может быть прямое взаимодействие или косвенное взаимодействие с вставленным вирусом. или фактор (ы) хозяина.Однако прямое или косвенное взаимодействие между этими двумя белками не было обнаружено дрожжевой двугибридной (Y2H) системой или анализами совместной иммунопреципитации (Li and Shirako, неопубликованные данные). Неспособность обнаружить взаимодействие VPg-eIF4E может быть связано с вероятной ошибочной укладкой VPg для взаимодействия с eIF4E в Y2H-системе, требованием низкой температуры для репликации BaYMV (You and Shirako, 2012), нестабильностью eIF4E-хозяина (Monzingo et al., 2007) или возможное возникновение слабого взаимодействия ниже предела обнаружения.Ранее сообщалось о невозможности продемонстрировать взаимодействие между eIF4E гороха и VPg, кодируемым PSbMV, который также является адаптированным к низким температурам вирусом (Congdon et al., 2016; Jones, 2016) (Gao et al., 2004). Тем не менее, мы предполагаем, что взаимодействие между BaYMV VPg и eIF4E действительно существует в ячмене-хозяине. Аминокислотные замены в eIF4E ячменя могут нарушить его взаимодействие с VPg и затем привести к устойчивости к инфекции BaYMV. По сравнению с eIF4E из восприимчивого сорта пять замен в аминокислотных положениях 57, 118, 205, 206 и 208 были обнаружены в rym4 eIF4E; три замены в положениях 120, 160 и 161 были обнаружены в rym5 eIF4E; и две замены в положениях 53 и 161 были обнаружены в rym6 eIF4E (Kanyuka et al., 2005; Hofinger et al., 2011; Таблица 2; Ли и Ширако, неопубликованные данные). Согласно трехмерной модели eIF4E ячменя (Kanyuka et al., 2005; Stein et al., 2005; Рисунок 5), все аминокислотные замены расположены в или около связывающего домена кэп-структуры. Как предсказано для пшеницы eIF4E (Monzingo et al., 2007), аминокислоты в положениях 160 и 161 близки к двум ключевым аминокислотам, 158 и 163, которые, как предполагается, расположены в области связывания структуры кэпа, что позволяет предположить, что аминокислоты в положении 160 и 161 также могут участвовать в связывании кэп-структуры РНК.Замена в любом из этих двух положений может привести к устойчивости к вирусной инфекции, как это произошло в rym5 и rym6 (Таблица 2). Кроме того, аминокислота в положении 118 была важна для стабилизации структуры белка, и замена в этом положении, как это произошло в rym4 eIF4E, также может влиять на функцию eIF4E (таблица 2).

РИСУНОК 5. Трехмерная (3D) модель белка КоА eIF4E ячменя. Предполагаемая трехмерная структура KoA eIF4E была предсказана сервером гомологического моделирования SWISS-MODEL. N-концевые 39 аминокислот КоА eIF4E невидимы в этой модели. Предполагаемый «карман» связывания кэпа расположен на левой стороне молекулы eIF4E. Аминокислотные остатки KoA eIF4E, выделенные красными боковыми цепями, указывают положения аминокислотных различий между белками eIF4E, кодируемыми растениями rym4, rym5 и rym6 (см. Таблицу 2). Остатки, выделенные желтыми рамками, были мутированы в этом исследовании.Трехмерное изображение было создано с помощью Swiss-PdbViewer.

Анализы на инфекционность, проведенные как с протопластами, так и с целыми растениями, были полезны для выяснения механизмов устойчивости. Становится ясно, был ли блокирован этап размножения или движения вируса во время реакций сопротивления. Во многих примерах заражения потивирусом была показана совместимость между VPg и eIF4E. Наши настоящие данные показывают, что как eIF4E, так и BaYMV VPg ячменя участвуют в размножении вируса и / или, предположительно, в перемещении вируса от клетки к клетке.Знания об аминокислотных остатках в eIF4E и VPg, которые имеют решающее значение для вирусной инфекции, могут быть использованы в программах селекции сельскохозяйственных культур, а также для наблюдения за появляющимися вариантами вируса, разрушающими устойчивость. Наконец, эта работа обеспечивает основу для дальнейшего понимания других механизмов рецессивной устойчивости растений.

Авторские взносы

HL и YS разработали план работы, провели эксперименты и анализ данных, а также составили первый вариант рукописи.ТК и Ю.С. предоставили материалы и реагенты. HL и HK нарисовали таблицы и рисунки. Первый вариант рукописи отредактирован и одобрен всеми авторами.

Финансирование

Работа поддержана исследовательской помощью Токийского университета (грант № 30010

). HL был поддержан программой докторских стипендий правительства Японии (номер гранта 111522).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Иду Багус Андика за полезные обсуждения и критическое чтение рукописи, двух рецензентов за их ценные предложения и комментарии, Сельскохозяйственную экспериментальную станцию ​​префектуры Точиги (филиал Тотиги) за предоставленные BaYMV-инфицированные листья сорта Микамо Голден, Sapporo Breweries Ltd., Гумма, Япония, за предоставление BaYMV-инфицированных листьев сорта Haruna Nijo, а также Ресурсному центру ячменя и дикорастущих растений Института растениеводства и ресурсов Университета Окаяма и Институту эпидемиологии и диагностики патогенов, Германия, за предоставление сорта ячменя.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01449

Сноски

  1. https://swissmodel.expasy.org/

Список литературы

Abdul-Razzak, A., Guiraud, T., Peypelut, M., Walter, J., Houvenaghel, M.-C., Candresse, T., et al. (2009). Участие белка цилиндрического включения (CI) в преодолении eIF4E-опосредованной устойчивости против потивируса мозаики салата . Мол. Завод Патол. 10, 109–113. DOI: 10.1111 / j.1364-3703.2008.00513.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Адамс, М., Зербини, Ф., Френч, Р., Рабенштейн, Ф., Стенгер, Д., и Валконен, Дж. (2012). «Семейство Potyviridae » в таксономии вирусов , 9-й отчет Международного комитета по таксономии вирусов , редакторы AMQ King, MJ Adams, EB Carstens и EJ Lefkowitz (Сан-Диего, Калифорния: Elsevier Academic Press), 1069– 1089.

Google Scholar

Адамс, М.Дж., Антонив Дж. Ф. и Бодуан Ф. (2005). Обзор и анализ сайтов расщепления полипротеинов в семействе Potyviridae . Мол. Завод Патол. 6, 471–487. DOI: 10.1111 / j.1364-3703.2005.00296.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ала-Пойкела, М., Гойтия, Э., Хайконен, Т., Раджамаки, М.-Л., и Валконен, Дж. П. Т. (2011). Хелперный компонент протеиназы рода Potyvirus является партнером по взаимодействию факторов инициации трансляции eIF (iso) 4E и eIF4E и содержит мотив связывания 4E. J. Virol. 85, 6784–6794. DOI: 10.1128 / JVI.00485-11

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андраде, М., Абэ, Ю., Накахара, К. С., и Уеда, И. (2009). Устойчивость cyv-2 к вирусу желтой жилки клевера в горохе контролируется эукариотическим фактором инициации 4Е. J. Gen. Plant Pathol. 75, 241–249. DOI: 10.1007 / s10327-009-0163-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арнольд, К., Бордоли, Л., Копп, Дж., и Schwede, T. (2006). SWISS-MODEL Workspace: веб-среда для моделирования гомологии структуры белков. Биоинформатика 22, 195–201. DOI: 10.1093 / биоинформатика / bti770

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Beauchemin, C., Boutet, N., and Laliberté, J.-F. (2007). Визуализация взаимодействия между предшественниками VPg, вирусным белком, связанным с геномом вируса мозаики репы , и фактором инициации трансляции iso 4E в planta. J. Virol. 81, 775–782. DOI: 10.1128 / JVI.01277-06

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Биазини М., Бинерт С., Уотерхаус А., Арнольд К., Студер Г., Шмидт Т. и др. (2014). SWISS-MODEL: моделирование третичной и четвертичной структуры белков с использованием информации об эволюции. Nucleic Acids Res. 42, W252 – W258. DOI: 10.1093 / nar / gku340

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бруун-Расмуссен, М., Мёллер, И.С., Тулиниус, Г., Хансен, Дж. К. Р., Лунд, О. С., и Йохансен, И. Е. (2007). Один и тот же аллель фактора инициации трансляции 4E опосредует устойчивость против двух видов Potyvirus spp. в Pisum sativum . Мол. Взаимодействие с растительными микробами. 20, 1075–1082. DOI: 10.1094 / MPMI-20-9-1075

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Charron, C., Nicolaï, M., Gallois, J. L., Robaglia, C., Moury, B., Palloix, A., et al. (2008). Естественная изменчивость и функциональный анализ свидетельствуют о совместной эволюции между растительным eIF4E и потивирусным VPg. Plant J. 54, 56–68. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2008.03407.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанг, Б. Ю., Миллер, В. А., Аткинс, Дж. Ф., и Ферт, А. Е. (2008). Перекрывающийся важный ген у Potyviridae. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105, 5897–5902. DOI: 10.1073 / pnas.0800468105

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клей, К., Ковер, П. X. (1996). Гипотеза красной королевы и взаимодействие растений и патогенов. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 29–50. DOI: 10.1146 / annurev.phyto.34.1.29

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Конгдон, Б.С., Куттс, Б.А., Рентон, М., и Джонс, Р.А.С. (2016). Вирус мозаики, переносимый семенами гороха: стабильность и ветровая контактная передача гороха полевого. Завод Dis. 10, 953–958. DOI: 10.1094 / PDIS-11-15-1249-RE

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эстеван, Дж., Марена, А., Калло, К., Лакомб, С., Моретти, А., Caranta, C., et al. (2014). Особые требования к фактору инициации трансляции 4E или его изоформе определяют чувствительность растения-хозяина к вирусу Tobacco etch virus . BMC Plant Biol. 14:67. DOI: 10.1186 / 1471-2229-14-67

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fraile, A., и García-Arenal, F. (2012). «Совместная эволюция вируса и растения» в eLS (Чичестер: John Wiley & Sons Ltd). DOI: 10.1002 / 9780470015902.a0023723

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Галлуа, Дж.-L., Charron, C., Sánchez, F., Pagny, G., Houvenaghel, M.-C., Moretti, A., et al. (2010). Изменения отдельных аминокислот в связанном с геномом белке вируса мозаики репы (VPg) придают вирулентность мутантам Arabidopsis thaliana , нокаутированным по факторам инициации эукариот eIF (iso) 4E и eIF (iso) 4G. J. Gen. Virol. 91, 288–293. DOI: 10.1099 / vir.0.015321-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гао, З., Йохансен, Э., Эйерс, С., Томас, К. Л., Ноэль Эллис, Т. Х., и Мауле, А. Дж. (2004). Ген рецессивной устойчивости к потивирусу, sbm1, определяет новую роль фактора инициации трансляции eIF4E в передаче от клетки к клетке. Plant J. 40, 376–385. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2004.02215.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Habekuss, A., Kühne, T., Krämer, I., Rabenstein, F., Ehrig, F., Ruge-Wehling, B., et al. (2008). Идентификация изолятов вируса мягкой мозаики ячменя в Германии, нарушающих устойчивость rym5 . J. Phytopathol. 156, 36–41.

Google Scholar

Харири Д., Мейер М. и Прюдом Х. (2003). Характеристика нового патотипа вируса мягкой мозаики ячменя во Франции. Eur. J. Plant Pathol. 109, 921–928. DOI: 10.1023 / B: EJPP.0000003663.32298.f4

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хьюлсагер, К. К., Олсен, Б. С., Йенсен, Д. М., Кордеа, М. И., Крат, Б. Н., Йохансен, И. Е. и др. (2006). Множественные детерминанты в кодирующей области вируса мозаики, передаваемого из семян гороха P3, участвуют в вирулентности против устойчивости к sbm-2. Вирусология 355, 52–61. DOI: 10.1016 / j.virol.2006.07.016

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hofinger, B.J., Russell, J.R., Bass, C.G., Baldwin, T., dos Reis, M., Hedley, P.E., et al. (2011). Исключительно высокое разнообразие нуклеотидов и гаплотипов и признак положительного отбора по гену устойчивости к eIF4E у ячменя выявлены с помощью аллельного анализа и филогенетического анализа природных популяций. Мол. Ecol. 20, 3653–3668. DOI: 10.1111 / j.1365-294X.2011.05201.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзян Дж. И Лалиберте Дж. Ф. (2011). Геном-связанный белок VPg вирусов растений — белок, имеющий множество партнеров. Curr. Opin. Virol. 1, 347–354. DOI: 10.1016 / j.coviro.2011.09.010

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йоханссон, М. У., Зоте, В., Михиелин, О., и Гекс, Н. (2012). Определение и поиск структурных мотивов с помощью DeepView / Swiss-PdbViewer. BMC Bioinformatics 13: 173.DOI: 10.1186 / 1471-2105-13-173

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонс, Р.А.С. (2016). Сценарии будущего развития патогенов вирусов растений по мере изменения климата. Adv. Virus Res. 95, 87–147. DOI: 10.1016 / bs.aivir.2016.02.004

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канг, Б.-К., Йем, И., и Ян, М.М. (2005a). Генетика устойчивости растений к вирусам. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 581–621. DOI: 10.1146 / annurev.phyto.43.011205.141140

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канг, Б.-К., Йем, И., Франц, Дж. Д., Мерфи, Дж. Ф., и Ян, М. М. (2005b). Локус pvr1 в Capsicum кодирует фактор инициации трансляции eIF4E, который взаимодействует с вирусом травления табака VPg. Plant J. 42, 392–405. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2005.02381.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канюка, К., Друка, А., Колдуэлл, Д. Г., Таймон, А., МакКаллум, Н., Во, Р. и др. (2005). Доказательства того, что рецессивный локус устойчивости к бимовирусу rym4 в ячмене соответствует гену эукариотического фактора инициации трансляции 4Е. Мол. Завод Патол. 6, 449–458. DOI: 10.1111 / j.1364-3703.2005.00294.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канюка, К., МакГранн, Г., Альхудаиб, К., Харири, Д., и Адамс, М. Дж. (2004). Биологический анализ и анализ последовательности нового европейского изолята вируса мягкой мозаики ячменя , который преодолевает ген устойчивости ячменя rym5 . Arch. Virol. 149, 1469–1480. DOI: 10.1007 / s00705-004-0318-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Касивадзаки, С., Огава, К., Усуги, Т., Омура, Т., и Цучизаки, Т. (1989). Характеристика нескольких штаммов вируса желтой мозаики ячменя. Ann. Фитопатол. Soc. Япония 55, 16–25. DOI: 10.3186 / jjphytopath.55.16

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кобаяси, С., Йошида, Х., Сотоме, К. (1987). Селекция на устойчивость к желтой мозаике пивоваренного ячменя. Ячмень Genet. Newsl. 5, 667–672.

Google Scholar

Кониши Т. и Кайзер Р. (1991). Генетические различия в устойчивости к вирусу желтой мозаики ячменя между Мокусекко 3 и Мисато Голден. Jpn. Дж. Брид. 41, 499–505. DOI: 10.1270 / jsbbs1951.41.499

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кюне, Т. (2009). Переносимые через почву вирусы, поражающие зерновые: давно известны, но все же представляют угрозу. Virus Res. 141, 174–183. DOI: 10.1016 / j.virusres.2008.05.019

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кюне Т., Ши Н., Прозелер Г., Адамс М. Дж. И Каньюка К. (2003). Способность бимовируса преодолевать опосредованную rym4 устойчивость ячменя коррелирует с изменением кодона в кодирующей области VPg на РНК1. J. Gen. Virol. 84, 2853–2859.

Google Scholar

Кайл, М., и Паллуа, А. (1997). Предлагаемый пересмотр номенклатуры генов устойчивости к потивирусу в Capsicum . Euphytica 97, 183–188. DOI: 10.1023 / A: 1003009721989

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонар С., Планте Д., Виттманн С., Даньо Н., Фортин М. Г. и Лалиберте Ж.-Ф. (2000). Образование комплекса между VPg потивируса и эукариотическим фактором инициации трансляции 4E коррелирует с инфекционностью вируса. J. Virol. 74, 7730–7737. DOI: 10.1128 / JVI.74.17.7730-7737.2000

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х., и Ширако Ю. (2015). Ассоциация VPg и eIF4E в тропизме хозяина на клеточном уровне вируса желтой мозаики ячменя и вируса желтой мозаики пшеницы в роду Bymovirus . Вирусология 476, 159–167. DOI: 10.1016 / j.virol.2014.12.010

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мякинен, К., Хафрен, А. (2014). Внутриклеточная координация функций потивирусной РНК при инфекции. Фронт. Plant Sci. 5: 110.DOI: 10.3389 / fpls.2014.00110

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Малис, Н., Маккарти, Дж. Э. (2011). Инициирование перевода: можно ожидать вариаций в механизме. Cell. Мол. Life Sci. 68, 991–1003. DOI: 10.1007 / s00018-010-0588-z

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Mazier, M., Flamain, F., Nicolaï, M., Sarnette, V., and Caranta, C. (2011). Нокдаун генов eIF4E1 и eIF4E2 придает томатам устойчивость широкого спектра действия против потивирусов. PLoS ONE 6: e29595. DOI: 10.1371 / journal.pone.0029595

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Монзинго, А. Ф., Дхаливал, С., Датт-Чаудхури, А., Лион, А., Садоу, Дж. Х., Хоффман, Д. В. и др. (2007). В структуре фактора инициации трансляции эукариот-4E из пшеницы обнаружена новая дисульфидная связь. Plant Physiol. 143, 1504–1518. DOI: 10.1104 / стр.106.093146

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Надерпур, М., Лунд, О.С., Ларсен, Р., Йохансен, Э. (2010). Устойчивость к потивирусу, полученная из сортов Phaseolus vulgaris , несущих bc-3 , связана с гомозиготным присутствием мутированного аллеля eIF4E . Мол. Завод Патол. 11, 255–263. DOI: 10.1111 / j.1364-3703.2009.00602.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Накахара К.С., Шимада Р., Чой С.-Х., Ямамото Х., Шао Дж. И Уеда И. (2010). Участие цистрона P1 в преодолении eIF4E-опосредованной рецессивной устойчивости против вируса желтой жилки клевера в горохе. Мол. Взаимодействие с растительными микробами. 23, 1460–1469. DOI: 10.1094 / MPMI-11-09-0277

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Nicaise, V., German-Retana, S., Sanjuán, R., Dubrana, M.-P., Mazier, M., Maisonneuve, B., et al. (2003). Фактор инициации трансляции эукариот 4E контролирует чувствительность салата к вирусу потивируса , вирусу мозаики салата . Plant Physiol. 132, 1272–1282. DOI: 10.1104 / стр.102.017855

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нисигава, Х., Хагивара, Т., Юмото, М., Сотоме, Т., Като, Т., и Нацуаки, Т. (2008). Молекулярно-филогенетический анализ вируса желтой мозаики ячменя . Arch. Virol. 153, 1783–1786. DOI: 10.1007 / s00705-008-0163-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Осато, С., Мияниши, М., Ширако, Ю. (2003). Оптимальная температура для репликации РНК в клетках, инфицированных Вирусом почвенной мозаики пшеницы , является 17 ° C. J. Gen. Virol. 84, 995–1000.DOI: 10.1099 / vir.0.19021-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Олсперт, А., Чанг, Б. Ю., Аткинс, Дж. Ф., Карр, Дж. П., и Ферт, А. Э. (2015). Проскальзывание транскрипции в семействе вирусов с положительной РНК Potyviridae . EMBO Rep. 16, 995–1004. DOI: 10.15252 / embr.201540509

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ordon, F., Habekuss, A., Kastirr, U., Rabenstein, F., and Kühne, T. (2009). Устойчивость к вирусам зерновых: источники устойчивости, генетика и селекция. J. Phytopathol. 157, 535–545. DOI: 10.1111 / j.1439-0434.2009.01540.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Реверс, Ф., и Гарсия, Дж. А. (2015). Молекулярная биология потивирусов. Adv. Virus Res. 92, 101–199. DOI: 10.1016 / bs.aivir.2014.11.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Робалья К. и Каранта К. (2006). Факторы инициации трансляции: слабое звено в заражении РНК-вирусом растений. Trends Plant Sci. 11, 40–45.DOI: 10.1016 / j.tplants.2005.11.004

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Родамиланс, Б., Валли, А., Мингот, А., Сан-Леон, Д., Баулкомб, Д., Лопес-Мойя, Дж. Дж. И др. (2015). Проскальзывание РНК-полимеразы как механизм продукции генных продуктов сдвига рамки считывания в растительных вирусах семейства Potyviridae . J. Virol. 89, 6965–6967. DOI: 10.1128 / JVI.00337-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Руде-Тавер, Г., Мишон, Т., Уолтер, Дж., Делоне, Т., Редондо, Э., и Ле Галл, О. (2007). Центральный домен VPg потивируса участвует во взаимодействии с фактором инициации трансляции хозяина eIF4E и вирусным белком HC-Pro. J. Gen. Virol. 88, 1029–1033. DOI: 10.1099 / vir.0.82501-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ruffel, S., Dussault, M.-H., Palloix, A., Moury, B., Bendahmane, A., Robaglia, C., et al. (2002). Ген естественной рецессивной устойчивости к вирусу Y картофеля в перце соответствует эукариотическому фактору инициации 4E (eIF4E). Plant J. 32, 1067–1075. DOI: 10.1046 / j.1365-313X.2002.01499.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Раффель С., Галлуа Дж. Л., Лесаж М. Л. и Каранта К. (2005). Рецессивный ген устойчивости к потивирусу pot-1 является ортологом томата гена pvr2-eIF4E перца . Мол. Genet. Геномика 274, 346–353. DOI: 10.1007 / s00438-005-0003-x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Раффель, С., Галлуа, Дж. Л., Моури, Б., Робалья, К., Паллуа, А., и Каранта, К. (2006). Одновременные мутации в факторах инициации трансляции eIF4E и eIF (iso) 4E необходимы для предотвращения инфицирования перца вирусом крапчатости вены перца. J. Gen. Virol. 87, 2089–2098. DOI: 10.1099 / vir.0.81817-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schaad, M.C., Anderberg, R.J. и Carrington, J.C. (2000). Штамм-специфическое взаимодействие белка NIa вируса травления табака с фактором инициации трансляции eIF4E в дрожжевой двугибридной системе. Вирусология 273, 300–306. DOI: 10.1006 / viro.2000.0416

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ширако Ю., Бракке М. К. (1984). Для заражения необходимы две очищенные РНК вируса мозаики пшеницы, переносимого через почву. J. Gen. Virol. 65, 119–127. DOI: 10.1099 / 0022-1317-65-1-119

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sotome, T., Kawada, N., Kato, T., Sekiwa, T., Nishigawa, H., Natsuaki, T., et al. (2010). Существующие и новые штаммы вируса желтой мозаики ячменя (BaYMV) в префектуре Тотиги. Jpn. J. Crop Sci. 79, 29–36. DOI: 10.1626 / jcs.79.29

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штейн Н., Перович Д., Кумлен Дж., Пеллио Б., Стракке С., Стренг С. и др. (2005). Фактор инициации трансляции эукариот 4E придает мультиаллельную рецессивную устойчивость к бимовирусу в Hordeum vulgare (L.). Plant J. 42, 912–922. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2005.02424.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тамада, Т., и Кондо, Х. (2013). Биологическое и генетическое разнообразие вирусов, передаваемых плазмодиофоридами, и их переносчиков. J. Gen. Plant Pathol. 79, 307–320. DOI: 10.1007 / s10327-013-0457-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tavert-Roudet, G., Abdul-Razzak, A., Doublet, B., Walter, J., Delaunay, T., German-Retana, S., et al. (2012). С-конец геликазы цилиндрического включения потивируса мозаики салата взаимодействует с вирусным VPg и с эукариотическим фактором инициации трансляции салата 4Е. J. Gen. Virol. 93, 184–193. DOI: 10.1099 / vir.0.035881-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трунигер В., Аранда М. А. (2009). Рецессивная устойчивость к вирусам растений. Adv. Virus Res. 75, 119–159. DOI: 10.1016 / S0065-3527 (09) 07504-6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, А., Кришнасвами, С. (2012). Эукариотическая рецессивная резистентность к вирусам растений, опосредованная фактором инициации трансляции 4E, и ее применение для улучшения сельскохозяйственных культур. Мол. Завод Патол. 13, 795–803. DOI: 10.1111 / j.1364-3703.2012.00791.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ямагути Ю., Сирако Ю. (2002). Разработка вектора временной экспрессии на основе РНК альфавируса Сагиямы. Microbiol. Иммунол. 46, 119–129. DOI: 10.1111 / j.1348-0421.2002.tb02668.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ямия, А., Сирако, Ю. (2000). Конструирование полноразмерных клонов кДНК Вируса почвенной мозаики РНК1 и РНК2, из которых транскрибируются инфекционные РНК in vitro : образование вирионов и системная инфекция без экспрессии N-концевых и С-концевых удлинений капсидный белок. Вирусология 277, 66–75. DOI: 10.1006 / viro.2000.0587

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йем, И., Каваторта, Дж. Р., Риполл, Д. Р., Канг, Б.-К., и Ян, М. М. (2007). Функциональное расчленение встречающихся в природе аминокислотных замен в eIF4E, которые придают растениям устойчивость к рецессивному потивирусу. Растительная клетка 19, 2913–2928. DOI: 10.1105 / tpc.107.050997

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ю Ю., Ширако Ю.(2010). Bymovirus обратная генетика: требования к кодируемым РНК2 белкам при системной инфекции. Мол. Завод Патол. 11, 383–394. DOI: 10.1111 / j.1364-3703.2010.00613.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ю Ю., Ширако Ю. (2012). Влияние аминокислоты в положении 132 в VPg на репликацию и системную инфекцию Вирус желтой мозаики ячменя . Virus Res. 166, 121–124. DOI: 10.1016 / j.virusres.2012.03.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вы, Ю., и Ширако Ю. (2013). Оценка устойчивости хозяина к инфекции вируса желтой мозаики ячменя на клеточном уровне и уровне всего растения. Завод Патол. 62, 226–232. DOI: 10.1111 / j.1365-3059.2012.02616.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhu, X., Wang, H., Guo, J., Wu, Z., Cao, A., Bie, T., et al. (2012). Картирование и проверка локусов количественных признаков, связанных с устойчивостью к бимовирусу желтой мозаики пшеницы в мягкой пшенице. Теор. Прил.Genet. 124, 177–188. DOI: 10.1007 / s00122-011-1696-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

(PDF) VPg мышиного норовируса связывает факторы инициации трансляции в инфицированных клетках

Опубликуйте с помощью BioMed Central, и каждый

ученый может бесплатно прочитать вашу работу

«BioMed Central станет наиболее значительным достижением для

, распространяющего результаты биомедицинских исследований в нашей жизни ».

Сэр Пол Медс, Cancer Research UK

Ваши исследовательские работы будут:

бесплатно доступны для всего биомедицинского сообщества

рецензируются и публикуются сразу после принятия

цитируются в PubMed и архивируются в PubMed Central

ваши — авторские права сохраняются за вами.

Разместите свою рукопись здесь:

http: // www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asp

BioMedcentral

Virology Journal 2006, 3:33 http://www.virologyj.com/content/3/1/33

Страница 7 из 7

(номер страницы не для цитирования)

2. Берроуз Дж. Н., Браун Ф .: Наличие ковалентно связанного белка

на РНК калицивируса. Дж. Ген Вирол 1978, 41: 443-446.

3. Герберт Т.П., Брайерли И., Браун Т.Д .: Идентификация белка

, связанного с геномной и субгеномной мРНК ицивируса кошачьего cal-

, и его роль в трансляции.J Gen Virol 1997, 78 (Pt

5): 1033-1040.

4. Сосновцев С., Грин KY: РНК-транскрипты, полученные из клонированной полноразмерной копии

генома калицивируса кошек,

не нуждаются в VpG для инфекционности. Virology 1995, 210: 383-390.

5. Даугенбо К., Фрейзер CSHJW, Харди М.Э .: Связанный с геномом белок VPg

вируса Норуолк связывает eIF3, что предполагает его роль

в рекрутинге комплекса инициации трансляции. EMBO J

2003, 22: 2852-2859.

6. Goodfellow I, Chaudhry Y, Gioldasi I, Gerondopoulos A, Natoni A,

Labrie L, Laliberte JF, Roberts L: инициация трансляции калицивирусов

требует взаимодействия между VPg и eIF 4 E. EMBO Rep

2005 , 6: 968-972.

7. Hershey JWB, Merrick WC: Путь и механизм инициации синтеза белка. Трансляционный контроль экспрессии гена

. Лабораторный пресс Колд-Сринг-Харбор, Колд-Спринг-Хар-

бор; 2000: 33-88.

8. Hentze MW: eIF4G: универсальный рибосомный адаптер? Science

1997, 275: 500-501.

9. Gingras AC, Raught B, Sonenberg N: факторы инициации eIF4: эффек- торы рекрутирования мРНК на рибосомы и регуляторы трансляции

. Анну Рев Биохим 1999, 68: 913-963.

10. Сарнов П., Севаллос Р.К., Ян Э .: Захват рибосом хозяина

дивергентных элементов IRES. Biochem Soc Trans 2005, 33: 1479-1482.

11. Hellen CU, Sarnow P: Внутренние сайты входа в рибосомы в молекулах отической мРНК эукари-

.Genes Dev 2001, 15: 1593-1612.

12. Karst SM, Wobus CE, Lay M, Davidson J, Virgin HW: STAT1-

-зависимый врожденный иммунитет к норволк-подобному вирусу. Science

2003, 299: 1575-1578.

13. Wobus CE, Karst SM, Thackray LB, Chang KO, Sosnovtsev SV, Belliot

G, Krug A, Mackenzie JM, Green KY, Virgin HW: Репликация норовируса

в культуре клеток обнаруживает тропизм к дендритным клеткам

и макрофаги. PLoS Biol 2004, 2: e432.

14. Мейер Л.Дж., Милберн С.К., Херши Дж.В.: Иммунохимический характер —

инициация факторов инициации синтеза белка у млекопитающих.

Biochemistry 1982, 21: 4206-4212.

15. Fontaine-Rodriguez EC, Taylor TJ, Olesky M, Knipe DM: Proteom-

-я клеточный белок 27, инфицированный вирусом простого герпеса: ассоциация с факторами инициации трансляции. Virology 2004,

330: 487-492.

16. Raught B, Gingras AC, Gygi SP, Imataka H, ​​Morino S, Gradi A, Aeber-

продано R, Sonenberg N: Сывороточно-стимулированный, чувствительный к рапамицину

сайта фосфорилирования в инициации трансляции эукариот

коэффициент 4GI.EMBO J 2000, 19: 434-444.

17. Мадер С., Ли Х., Пауза А., Соненберг Н.: Фактор инициации трансляции

eIF-4E связывается с общим мотивом, общим для трансляционного фактора

eIF-4 gamma и репрессоров трансляции

4E -связывающие белки. Mol Cell Biol 1995, 15: 4990-4997.

18. Уиллкокс М.М., Картер М.Дж., Робертс Л.О.: Расщепление эукариотического фактора инициации

eIF4G и ингибирование синтеза белка клетки-хозяина

во время инфекции калицивирусом кошек.J Gen Virol 2004,

85: 1125-1130.

19. Куюмку-Мартинез М., Беллиот Г., Сосновцев С.В., Чанг К.О., Грин

KY, Ллойд Р.Э .: Калицивирусная 3C-подобная протеиназа ингибирует клеточную трансляцию

путем расщепления поли (A)-связывающего белка. Дж. Вирол

2004, 78: 8172-8182.

20. Dunham DM, Jiang X, Berke T., Smith AW, Matson DO: Genomic

картирование калицивируса VPg. Arch Virol 1998, 143: 2421-2430.

21. Козак М. Короткая лидерная последовательность нарушает точность инициации эукариотическими рибосомами.Джин Экспр 1991, 1: 111-115.

22. Пестова Т.В., Колупаева В.Г. Роль отдельных факторов инициации трансляции эукариот

в сканировании рибосом и выборе кодонов инициации

. Genes Dev 2002, 16: 2906-2922.

23. Сосновцев С.В., Грин К.Ю.: Идентификация и геномное картирование

белков ORF3 и VPg в вирионах калицивируса кошек.

Virology 2000, 277: 193-203.

24. Грин К.Ю., Мори А., Фогг М.Х., Вайсберг А., Беллиот Г., Вагнер М.,

Митра Т., Эренфельд Э., Камерон С.Е., Сосновцев С.В.: Выделение

ферментативно активных репликационных комплексов из семейства кошачьих

клетки, инфицированные цивирусом.Дж. Вирол, 2002, 76: 8582-8595.

25. Сосновцев С.В., Гарфилд М., Грин К.Ю.: Карта процессинга и основные сайты расщепления

неструктурного полипротеина, кодируемого

ORF1 генома калицивируса кошек. 2002.

26. Сосновцев С.В., Беллиот Дж., Чанг К.О., Онвудиве О., Грин KY:

Калицивирус кошек VP2 необходим для производства инфекционных

вирионов. Дж. Вирол 2005, 79: 4012-4024.

Picornaviridae ~ ViralZone

Взаимодействие хоста с вирусом

Модуляция апоптоза

Пикорнавирусы модулируют апоптоз хозяина.

Полиовирусная инфекция активирует апоптотический путь, включая повреждение митохондрий, отток цитохрома с и последовательную активацию каспаз (каспаза-3 и -9), тогда как антиапоптотическая активность приписывается лидерному белку кардиовируса.

Модуляция апоптоза зависит от типа клетки-хозяина и от времени инфицирования из-за присутствия вирусных про- и антиапоптотических факторов соответственно в начале и в конце инфекционного цикла .

Модуляция аутофагии

Пикорнавирусы разрушают аутофагический путь клетки, способствуя вирусной инфекции:

— Человеческий риновирус 2 и EMCV активируют аутофагический путь
— Вирус ящура использует аутофагический путь
— Инфекция вируса Коксаки и полиовируса индуцирует везикулы, подобные аутофагии

Подавление врожденного иммунного ответа

Пикорнавирусы ингибируют IFN-опосредованный ответ хозяина, инактивируя MDA-5, RIG-I, MAVS или IRF-3:
— HAV расщепляет и ингибирует MAVS
— Вирус Коксаки B3 расщепляет и ингибирует MAVS
— Энтеровирусы и кардиивирусы расщепляют и ингибируют RIG-I
-Полиовирус расщепляет и ингибирует MDA-5
— Лидерные белки вируса менговируса и ящура ингибируют IRF-3 .

Пикорнавирусы также ингибируют противовирусный ответ, опосредованный Toll-подобным рецептором 3:

— протеазы вируса Коксаки B 3C, HAV и энтеровируса 71 3C расщепляют TRIF .

Выключение экспрессии гена хозяина вирусом

Пикорнавирусы ингибируют трансляцию хозяина, расщепляя различные факторы трансляции, такие как PABP (ящур, полиовирус и вирус Коксаки) , eIF3a, eIF3b (ящур) , eIF5B и активируя 4E-BP1.

Полиовирус также подавляет транскрипцию хозяина, расщепляя ТАТА-связывающий белок.

Некоторые энтеровирусы или кардиовирусы также ингибируют экспорт мРНК хозяина.

Insights of the Functions of the EIF4E-Biding Motif of VPg in Potato Virus A Infection.

Ссылки

1 февраля 1994 г. · Журнал общей вирусологии · U PuurandM Saarma

1 февраля 1996 г. · Исследование вирусов · Puurand UM Saarma

8 июля 1999 г. · Молекулярная клетка · J MarcotrigianoS K Burley

7 января 2000 г. · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · М.Л. Раджамаки, JP Valkonen

29 июня 2000 г. · Ежегодный обзор биохимии · AC GingrasN Sonenberg

10 августа 2000 г. · Журнал вирусологии · S LéonardJ F Laliberté

15 февраля 2001 г. · Исследование вирусов · I OruetxebarriaJ P Valkonen

2 июня 2001 г. · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · B Borgstrøm, IE Johansen

7 марта 2002 г. · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · Minna-Liisa Rajamäki, Jari PT Valkonen

19 июля 2002 г. · Текущая биология: CB · Эндрю Д. Леллис Джеймс К. Кэррингтон

21 декабря 2002 г. · The Plant Journal: для клеточной и молекулярной биологии · Энн Дюпра Кристоф Робалья

15 июля 2003 г. · Plant Физиология · Валери Никаи seOlivier LeGall

6 марта 2004 г. · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · Бенуа Моури, Мирей Жакемон

26 июня 2004 г. · Журнал биологической химии · Пьетри Пуустинен, Кристина Мякинен

июля 24 · 2004 · Биохимическое общество Браунинг

16 февраля 2005 г. · Письма FEBS · Масанао СатоИчиро Уеда

17 мая 2005 г. · Вирусология · Рой Аниндиа С. Савитри

14 декабря 2005 г. · Тенденции в растениеводстве · Кристоф Робалья, Кэрол Каранта

8 марта 2006 г. · Журнал FEBS · Тьерри МишонОливье Ле Галл

24 февраля 2007 г. · Письма FEBS · Валери НиказСильви Герман-Ретана

27 февраля 2007 г. · Физиология растений · Артур Ф. Монцинго Карен С. Браунинг

28 февраля 2007 г. Вирусология · G Roudet-TavertO Le Gall

, 14 сентября 2007 г. · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · M Bruun-RasmussenI E Johansen

30 ноября 2007 г. · Журнал биологической химии · Mateen A KhanDixie J Goss

9 0004 10 января 2008 г. · Журнал растений: клеточная и молекулярная биология · Карин ЧарронКароль Каранта

28 июня 2008 г. · Биохимия · Хироши МиёсиТомохиде Нацуаки

6 января 2009 г. · Журнал биохимии · Хаято ОкадеТошимаса Исида

февраля 2009 · Журнал биологической химии · Роберт Э. Роадс

11 сентября 2009 г. · Журнал общей вирусологии · Жан-Люк ГаллуаСильви Герман-Ретана

23 декабря 2009 г. · Журнал вирусологических методов · К. Эскелин К. Мякинен

30 января , 2010 · Достижения в вирусных исследованиях · В. Трунигер, MA Aranda

3 августа 2010 г. · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · Кэрол Э. ДженнерДжон Э. Уолш

29 апреля 2011 г. · Журнал вирусологии · Марджо Ала-ПойкелаДжари П.Т. Валконен

3 мая 2011 г. · Ячейка · Иван Тописирович, Наум Соненберг

24 июня 2011 г. · Журнал вирусологии · Катри ЭскелинКристийна Мякинен

16 сентября 2011 г. · Журнал общей вирусологии · Г. Таверт-РудеТ Кандресс

25 октября , 2011 · М Молекулярная патология растений · Карен-Бет Г. ШолтофГэри Д. Фостер

25 января 2012 г. · Журнал растений: клеточная и молекулярная биология · Йоханнес Шенбергер, Томас Дрессельхаус

3 марта 2012 г. · Молекулярная патология растений 3, 2012 · PloS One · Deshui LiuYongliang Zhang

9 ноября, 2012 · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · Кари ПересМолли М. Ян

21 декабря 2012 · Молекулярные взаимодействия растений и микробов: MPMI · Карлос А. Контрерас-Паредес Цветанка D Динкова

1 февраля 2013 г. · Журнал вирусологии · Андерс ХафренКристийна Мякинен

17 октября 2013 г.

Впг инфекция что это: Герпес-вирус человека 1 и 2 типа (вирус простого герпеса 1 и 2 типа), определение ДНК, типирование (Human herpesvirus 1, 2, Herpes simplex virus 1, 2 (HSV-1, HSV-2), DNA) в соскобе эпителиальных клеток кожи

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.