Тест по слюне на овуляцию: Тест на овуляцию по слюне микроскоп Цикл с тест полосками по выгодной цене

¹ Инженерное отделение в медицине, Медицинский факультет, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Хемант Кандула

¹ Инженерно-техническое отделение медицины, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бост on, MA, USA

Prudhvi Thirumalaraju

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Manoj Kumar Kanakasabapathy

1^{4 Инженерное дело в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Сандип Кота Сай Паван

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардский медицинский университет Школа, Бостон, Массачусетс, США

Дивьянк Ярраварапу

¹ Инженерно-техническое отделение Медицинского факультета, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Ананд Сундарараджан

^{5 Отделение 1 инженерии в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Ka Ртик Баскар

¹ Инженерное отделение медицины, Медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Neeraj Gudipati

¹ Инженерное отделение медицины, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

John С.

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Больница общего профиля Массачусетса, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США , Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Медицинский факультет, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

¹ Инженерное отделение в медицине, Женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Массачусетская больница общего профиля, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Отделение Медицина, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

^# Внесли равный вклад.

Авторские взносы

Abstract

Возможность точного прогнозирования овуляции в домашних условиях с помощью недорогой диагностики в месте оказания медицинской помощи может оказаться существенной помощью для пар, предпочитающих естественное планирование семьи. Обнаружение гормонов, специфичных для овуляции, в образцах мочи и мониторинг базальной температуры тела в настоящее время являются общепринятыми домашними методами, используемыми для обнаружения овуляции; однако эти методы относительно дороги для длительного использования, а результаты трудно понять. Здесь мы сообщаем об устройстве на базе смартфона для автоматизированного тестирования овуляции с использованием искусственного интеллекта (ИИ) путем обнаружения узоров папоротника в небольшом объеме (<100 мкл) слюны, высушенной воздухом на микрофлюидном устройстве.Мы оценили работу устройства с использованием образцов искусственной слюны и слюны человека и обнаружили, что устройство показало точность >99% в эффективном прогнозировании овуляции.

Graphical Abstract

Недорогой, быстрый, автоматизированный микрочип на базе смартфона для тестирования овуляции путем обнаружения структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны с использованием искусственного интеллекта.

Введение

Планирование семьи укрепляет права людей определять количество детей и интервалы между их рождением.Время полового акта по отношению к овуляции сильно влияет на вероятность успешного зачатия и может быть эффективным методом естественного планирования семьи ¹ . Почти 44% всех беременностей во всем мире являются незапланированными или непреднамеренными ^{2, 3} . Непреднамеренная беременность может иметь неблагоприятные последствия для здоровья как матери, так и ребенка и сопряжена со значительным экономическим и социальным бременем. Кроме того, только в 2010 году расходы на роды, аборты и выкидыши в результате незапланированной беременности составили более 21 миллиарда долларов государственных средств в США ^{4, 5} .Исследование также показало, что услуги по планированию семьи сами по себе помогли снизить число нежелательных беременностей и связанные с этим расходы почти на 70% ^{5, 6} . Простой недорогой инструмент, который может помочь в планировании семьи, поможет женщинам избежать нежелательной беременности и будет иметь большое значение для тех пациенток, которые пытаются зачать ребенка.

Естественное планирование семьи использует физические признаки, симптомы и физиологические изменения для прогнозирования фертильности женщины ^{7, 8} . Некоторые из методов мониторинга женской фертильности включают обнаружение овуляции посредством определения уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ), оценку активности бета-глюкуронидазы в слюне, ректальный или оральный анализ базальной температуры тела, характеристику цервикальной слизи и анализ слюнного папоротника ⁹ .Анализ слюнных папоротников относительно недорог и прост, что делает его привлекательной альтернативой большинству доступных подходов ¹⁰ . Во время фолликулярной фазы менструального цикла с повышением уровня эстрадиола в крови происходит увеличение электролитов слюны, что приводит к стойкому папоротниковому виду, кристаллизованной структуре, напоминающей листья папоротника, в высушенной на воздухе слюне и может быть использовано для определить период овуляции ^{10, 11} . Структуры папоротника наблюдались у овулирующих женщин в течение 4-дневного окна около дня овуляции ¹² .Тем не менее, современные тесты на овуляцию, основанные на слюнном папоротнике, являются ручными и очень субъективными, что вызывает неправильную интерпретацию, когда их выполняет непрофессиональный потребитель ¹³ .

Искусственный интеллект (ИИ) получает признание в медицине, и одним из основных его применений в здравоохранении является его способность точно интерпретировать сложные медицинские данные со сверхчеловеческой точностью и последовательностью ¹⁴ . Уже было показано, что ИИ исключительно хорошо работает в таких приложениях, как прогнозирование риска сердечно-сосудистых заболеваний ¹⁵ , скрининг рака кожи ¹⁶ и обнаружение диабетической ретинопатии ¹⁷ .Достижения в области микроэлектроники и машинного обучения позволили современным методам, основанным на искусственном интеллекте, одинаково хорошо работать на портативных системах, особенно на смартфонах. Смартфонами пользуются более 4,4 миллиарда человек по всему миру, что делает их отличным кандидатом на разработку технологий для оказания медицинской помощи ¹⁸ . Фактически, камеры смартфонов использовались в тестах по месту оказания медицинской помощи как для качественного, так и для количественного определения клинически значимых биомаркеров для выявления заболеваний или мониторинга лечения, таких как выявление ВИЧ/СПИДа и сифилиса ^19–21 , герпеса ²² , серповидноклеточная анемия ²³ , мужское бесплодие ^24–29 и Зика ^{30, 31} .

Здесь мы сообщаем о простом, недорогом и автоматизированном устройстве на базе смартфона для тестирования овуляции по месту оказания медицинской помощи, которое использует искусственный интеллект для точного обнаружения паттернов папоротника в небольшом объеме (~ 100 мкл) воздушно-сухой слюны. образцы помещают на микрожидкостное устройство (). Мы использовали нейронную сеть для быстрого (менее 31 секунды) анализа и обнаружения папоротников в высушенных на воздухе образцах слюны. Нейронная сеть использует архитектуру MobileNet, предварительно обученную на 1,4 миллионах изображений ImageNet и повторно обученную на изображениях слюнных папоротников.Устройство на базе смартфона смогло определить овуляцию с точностью 99,5% при тестировании 200 изображений человеческой слюны, собранных во время овуляционных и неовуляционных фаз менструального цикла у 6 женщин.

(A) Слюну собирают на микрожидкостном устройстве, смазывают тампоном и оставляют для сушки на воздухе. (B) Оптическая система подключена к совместимому смартфону для тестирования.(C) Микрожидкостное устройство с высушенным на воздухе образцом вставляется в оптическую насадку, и тест инициализируется с помощью разработанного пользовательского приложения для Android. (D) Программное обеспечение анализирует образец папоротника, демонстрируемый высушенными на воздухе образцами слюны, и определяет, находится ли субъект в овуляционной или неовуляционной фазе менструального цикла.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Целью данного исследования была разработка автоматизированного устройства для определения овуляции у женщин с помощью теста слюнного папоротника.В исследовании приняли участие 6 здоровых женщин в возрасте от 20 до 22 лет. Субъекты были отобраны на основе следующих критериев: 1) у них в анамнезе были нормальные менструальные циклы; 2) Они не употребляли табак и алкоголь и 3) Они не использовали гормональную контрацепцию в течение периода исследования. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Набранные субъекты предоставили информированное согласие до сбора образцов слюны.Каждому испытуемому давали микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл для сбора образца рано утром перед чисткой зубов. Образцы слюны собирали во время овуляционных и неовуляционных фаз. Две различные фазы были идентифицированы с использованием теста мочи Clear Blue ^® (ЛГ + эстроген) в качестве эталона. Образцы загружали в микрожидкостное устройство и анализировали с помощью оптической системы на базе смартфона. Также был проведен ручной анализ на наличие слюнного папоротника с использованием микроскопа на этапе обучения сети.

Оптическая насадка

Для проведения этого исследования мы разработали оптическую насадку для смартфона (83 × 97 × 74 мм), которая была напечатана на 3D-принтере с помощью Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и полимолочной кислоты (PLA) (Ultimaker). печатный материал (). Оптическая схема прибора содержала плосковыпуклую линзу диаметром 9 мм с фокусным расстоянием 13,5 мм для увеличения и стандартную акриловую линзу диаметром 12 мм с фокусным расстоянием 30 мм в качестве конденсора. Объективы были совмещены с оптической осью фронтальной камеры смартфона.Насадка была разработана в SolidWorks (Dassault Systèmes) для смартфона Moto X (Motorola, XT1575). Движение микрофлюидного устройства по оси X (параллельно установке линзы) было достигнуто с помощью редукторного двигателя постоянного тока 6 В, 100 об / мин (B07556CZL1, Walfront) с ходовым винтом M3, прикрепленным к валу. Устройство питалось от щелочной батареи 9 В (B000099SKB, Energizer). Для освещения микрофлюидного чипа использовали рассеянный белый светоизлучающий диод (LED) 5 В (IL153, ​​Microtivity). Одноплатный микроконтроллер (NodeMCU) использовался для управления движением микрожидкостного устройства.Принципиальная схема установки приведена в дополнительной информации (рис. S1).

(A) Покомпонентное изображение автономной оптической системы и ее различных компонентов. Система управляется по беспроводной связи с помощью смартфона для отображения структур папоротника на микрофлюидном устройстве. (B) Фактическое изображение изготовленной автономной оптической системы со смартфоном для визуализации и анализа структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны.(C) Взрыв микрофлюидного устройства с блоком мазка. (D) Фактическое микрожидкостное устройство, помещенное рядом с монетой в четверть доллара США.

Изготовление микрожидкостных устройств

Микрожидкостное устройство состояло из поли(метилметакрилата) (ПММА) (8560K239, McMaster Carr), двустороннего клея (DSA), полимолочной кислоты (PLA) и предметного стекла (VWR, 48300–025). Corning 75×25 мм). Прозрачные листы PMMA и DSA вырезали с помощью лазерного резака (VLS 2.3, Universal Laser Systems Inc.). Лазерный резак также использовался для контролируемого травления ПММА для создания канавок. Канавки были протравлены на ПММА таким образом, чтобы внутренняя сторона полностью построенного микрофлюидного чипа служила направляющими для блока мазка. Небольшой участок (25 × 12 мм ² ) был оставлен открытым на одном конце предметного стекла для работы с микрожидкостным устройством (). Одна сторона DSA была приклеена к протравленной стороне канавки ПММА, а другая сторона была приклеена к предметному стеклу, которое использовалось в качестве нижней подложки для микрочипа.Мазковый блок (12 × 8 × 9,6 мм) был напечатан с использованием 3D-принтера Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и PLA в качестве материала для печати. Блок мазка использовался для смазывания образца внутри канала (40 × 5 мм ² ) микрожидкостного устройства для получения контролируемой тонкой пленки слюны. Микрожидкостное устройство также имело небольшой резервуар для загрузки образца на чипе.

Приложение для Android

Приложение для Android было разработано для сбора данных изображений с помощью оптической насадки смартфона и анализа узоров папоротника, присутствующих в высушенной воздухом слюне, для прогнозирования статуса овуляции.Когда микрофлюидное устройство с загруженным образцом было вставлено в оптическую насадку, микрофлюидное устройство перемещалось параллельно установке линзы для автоматического изображения всего канала слюнного папоротника. Приложение для Android управляло двигателями через NodeMCU и, следовательно, движением микрофлюидного устройства. Беспроводная связь между смартфоном и оптической системой была достигнута за счет настройки NodeMCU в качестве веб-сервера HTTP. Приложение захватывает видеокадры микроканала со скоростью ~ 5 кадров в секунду (fps).

Видеокадры были отобраны с 4-кратным увеличением, и каждый кадр был передан в обученную сеть для обнаружения присутствия папоротника. Время вывода для получения результата для каждого кадра составило ~200 мс для смартфона Moto X и может различаться для разных смартфонов. Пользовательский интерфейс приложения для смартфона был разработан, чтобы быть простым и удобным в использовании. Кроме того, результаты сохранялись в календарном событии для отслеживания цикла овуляции. Приложение для Android автоматически захватывает видеокадры, локально анализирует изображения и сообщает результат менее чем за 31 с.Для анализа не требуется доступ в интернет.

Сбор данных

Добровольных участников попросили собрать образцы слюны рано утром перед чисткой зубов, чтобы исключить любые расхождения в концентрации электролитов в слюне из-за повседневной деятельности человека. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Мы собирали образцы каждый день у каждой участницы в течение одного полного менструального цикла и тестировали их с помощью наших микрожидкостных устройств как во время овуляционной, так и неовуляционной фаз.Мы также использовали искусственную слюну для имитации узоров папоротника для обучения и тестирования алгоритма ИИ. Мы смоделировали 30 неовулирующих образцов в диапазоне от 0,1% до 1,4% и 34 овулирующих образца в диапазоне от 5,6% до 100% запаса искусственной слюны. Образцы были подготовлены, чтобы охватить широкий спектр папоротниковых и непапоротниковых структур. Подготовленные образцы загружали в микрожидкостные устройства и размазывали по узкому каналу с помощью размазывающего блока. Образцы высушенной на воздухе слюны затем визуализировались с помощью оптической системы на базе смартфона.Всего было получено 1640 изображений из образцов слюны человека и искусственной слюны, которые были классифицированы на 476 изображений с овуляцией и 1164 изображения без овуляции на основе паттернов папоротника. Аннотации для образцов с папоротником и без папоротника были получены путем ручного осмотра смоделированных образцов под настольным микроскопом. Статус овуляции для образцов человеческой слюны был установлен с помощью анализа мочи (ЛГ + эстроген) в дополнение к ручной проверке.

Обучение MobileNet

Чтобы классифицировать структуры папоротника на смартфоне, MobileNet предварительно обучен 1.В качестве архитектуры нашей нейронной сети ³² использовалось 4 миллиона изображений ImageNet с параметром множителя ширины α=0,50 и размером изображения 224×224 пикселя. ImageNet, набор данных с открытым исходным кодом, который содержит изображения без слюны из различных категорий, помог в предварительном обучении сети. Для сложной архитектуры нейронной сети, такой как MobileNet, набора данных примерно из 1500 изображений недостаточно для оптимизации их весов во время обучения. Поэтому мы использовали разнообразный крупномасштабный набор данных, чтобы «предварительно обучить» сеть, а затем уточнить ее, чтобы она работала для нашего приложения для анализа слюнных папоротников. Используемая модель MobileNet работала с точностью 1 первого уровня 64,0% и точностью 5 топового уровня 85,4 % по 1000 классам базы данных ImageNet.

MobileNet был специально разработан для эффективного использования ограниченных ресурсов, доступных на встроенных устройствах, таких как смартфоны. Сеть использует свертки с разделением по глубине для построения облегченных глубоких нейронных сетей, в отличие от традиционных нейронных сетей свертки, которые используют стандартную двумерную свертку. Стандартная двумерная свертка применяет ядро ​​свертки ко всем каналам входного изображения.2D-свертка перемещает ядра по всем каналам входного изображения и вычисляет взвешенную сумму входных пикселей, применяемых ядром для всех входных каналов. Глубинная свертка — это пространственная разделимая свертка, выполняемая на отдельных каналах, выходные данные которой вычисляются в новый канал с помощью точечной свертки (стандартная свертка с ядром 1×1).

Структуры MobileNet были построены с помощью разделимых по глубине сверток, за исключением первого слоя, который был построен со стандартной сверткой 3×3. За каждым сверточным слоем следует выпрямленная линейная единица (ReLU) и нормализация партии. Последний уровень MobileNet содержит средний объединяющий слой для уменьшения пространственного разрешения до 1, за которым следует полносвязный слой, который был передан на наш уровень классификации для обнаружения. Выборка вниз выполнялась с помощью шаговой свертки в свертках по глубине, а также в первом слое. Вместо обучения модели с нуля была использована техника трансферного обучения. Мы использовали предварительно обученные веса MobileNet, который был обучен на ImageNet для повторного использования его возможностей извлечения признаков.Слой классификации был добавлен в конце и был обучен классифицировать образцы слюны на овулирующие и неовулирующие на основе шаблонов папоротника. Только классификационный слой был обучен, а остальные слои остались нетронутыми. Выходные данные полностью подключенного слоя оставались одинаковыми для каждого изображения, и выходные данные использовались несколько раз. Поскольку расчет результатов занимал значительное время, мы создали узкие места на выходе, чтобы сократить время обучения. Выходные данные полносвязного слоя использовались в качестве входных данных для слоя классификации.Истинные метки передавались в сеть как наземные, и вычислялись точность, перекрестная энтропия и градиенты ().

(A) Вычислительный поток данных. (B) Набор данных папоротниковых и непапоротниковых изображений был обучен и проверен на более чем 4000 тренировочных шагов со скоростью обучения 0,01. К 4000-му шагу обучения точность проверки и потеря перекрестной энтропии достигли предела.

Эффективность обучения измерялась перекрестной энтропией, которая использовалась в качестве функции потерь, чтобы узнать, насколько хорошо сеть обучается. Точность обучения — это процент правильно помеченных изображений в обучающем пакете, а точность проверки — это процент правильно помеченных изображений, отличных от изображений в обучающем пакете. Разница между двумя точностями использовалась для определения того, является ли модель переоснащением.

Для трансферного обучения мы повторно обучили MobileNet, предварительно обученную на ImageNet, для 4000 обучающих шагов (эпох) со скоростью обучения, установленной на 0.01 с использованием наших наборов данных слюны. Вес модели, достигший наименьшей потери перекрестной энтропии, сохранялся и использовался. На 1000 ^-м шаге обучения потеря перекрестной энтропии при проверке составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45% (). В рамках процесса обучения размеры всех изображений, используемых во время обучения, были изменены до 224×224 пикселей с использованием библиотек компьютерного зрения (OpenCV) и обучены в среде TensorFlow. Обученная таким образом нейронная сеть выполняла всю обработку и анализ локально, без необходимости доступа к Интернету.

Методы визуализации данных

Карты значимости были созданы с использованием TensorFlow. SmoothGrad, примененный к выходным данным, полученным из полносвязного слоя свертки, использовался для повышения резкости карт чувствительности на основе градиента ^{33, 34} . Мы сопоставили активации слоя активации сразу после полносвязного слоя свертки. При создании карт заметности использовались изображения как искусственной слюны, так и изображений тестового набора слюны человека. Встраивание стохастических соседей по t-распределению (t-SNE) было выполнено для наблюдения за распределением набора тестовых данных в 2D-пространстве и для проверки того, способна ли наша модель точно различать овулирующие и неовулирующие образцы.

Искусственная слюна

Искусственная слюна использовалась для имитации папоротников. Состав искусственной слюны следующий: 0,92 г/л ксантановой камеди (Q8185, MP Biomedicals), 1,2 г/л хлорида калия (L1117, Chemcruz), 0,85 г/л хлорида натрия (031M0215V, Sigma), 0,05 г. л хлорида магния (030M0060V, Sigma), 0,13 г/л хлорида кальция (057K0005, Sigma), 0,13 г/л дикалия гидроортофосфата (SLBS6839, Sigma) и 0,35 г/л метил-п-гидроксибензоата (Q7915, MP биомедицинские препараты).рН искусственно приготовленной слюны составлял 7,0. pH нормальных образцов слюны колеблется от 6,2 до 7,6. Мы подготовили исходный раствор и разбавили его деионизированной водой, чтобы имитировать образцы слюны, полученные от овулирующих и неовулирующих людей. Ниже приводится разбивка концентраций искусственной слюны, показывающая три фазы папоротника: непапоротниковый — от 0,1% до 1,4%, переходный — от 1,5% до 5,6% и папоротниковый — от 5,6% до 100% приготовленного запаса искусственной слюны.

Результаты

Характеристика оборудования для анализа овуляции на основе смартфона

Система тестирования овуляции на основе смартфона была разработана таким образом, чтобы быть простой и с минимальным вмешательством пользователя (, ).Аппаратные компоненты системы состояли из оптической насадки для смартфона для увеличения изображения образца и микрожидкостного устройства для работы с образцом слюны (, ). Оптическая насадка для смартфона, напечатанная на 3D-принтере, была легкой (208 г) и компактной (83 × 70 × 74 мм). Он использовал переднюю камеру смартфона для изображения и был прикреплен к телефону с помощью простого надвижного механизма. Увеличение изображения, достигнутое системой смартфона, составило 4×, что было сравнимо с цифровыми изображениями, полученными с помощью стандартного лабораторного микроскопа (Carl Zeiss AG Axio Observer D1) при 10-кратном увеличении.Эффективное поле зрения системы составляло 2,19 × 2,95 мм. Отображая микрометровый масштаб с помощью оптической системы, мы заметили, что 1 мкм на записанном изображении представлен 0,226 пикселями (рис. S2A), однако разрешение оптической системы сотового телефона составляло 7 мкм, что было установлено при отображении изображения 1951 года. Целевое разрешение ВВС США (USAF) (рис. S2B). Система была моторизована вдоль одной оси и фокальной плоскости для автоматизации визуализации микрожидкостного канала. Микрожидкостное устройство, содержащее образец слюны, было оптимально сфокусировано путем размещения устройства на рабочем расстоянии от установки линзы, что помогло исключить ручную фокусировку пользователем.Общая стоимость материала для изготовления аксессуара для смартфона и микрофлюидного устройства составила 13,91 доллара США, включая 13,58 доллара США на оптическую насадку и 0,33 доллара США на микрофлюидное устройство (таблица S1). Приложение для смартфона было разработано, чтобы направлять пользователя на каждом этапе тестирования (рис. S3). Разработанная система записывала видео со скоростью ~ 5 кадров в секунду, покрывая площадь 2,1 × 22,6 мм ² микрофлюидного устройства за <31 секунду на образец, в течение которых приложение для смартфона отображало, локально анализировало и сообщало результат.

Микрожидкостное устройство для работы с образцами

Микрофлюидное устройство было разработано с резервуаром для загрузки образца слюны и узким микроканалом для визуализации воздушно-сухого образца. Образец слюны наносится на зону визуализации устройства с помощью простого накладного блока, напечатанного на 3D-принтере ()

. Среднее время высыхания образца слюны на микрожидкостном устройстве составило 6,7 ± 1,5 минуты по сравнению с минимальными 25 минутами. на обычном предметном стекле (n=8, по 3 повторности) (рис.С4). Был проведен регрессионный анализ методом наименьших квадратов, и наклоны линий для микрожидкостных устройств и групп предметных стекол составили 0,008 (95% доверительный интервал: от -0,003 до 0,02) и 0,52 (95% доверительный интервал: 0,29 до 0,74) со значениями R ² 0,30 и 0,97 соответственно (рис. S4). При размазывании образца создается тонкая пленка на стеклянной подложке микрофлюидного устройства, что минимизирует время высыхания образца независимо от его объема.

Работа системы в искусственной слюне

Образцы искусственной слюны использовались для обучения нейронной сети.Используя 492 аннотированных изображения, состоящих из 168 изображений с узорами папоротника и 324 изображений без узоров папоротника, мы переобучили и проверили нашу модель для классификации изображений на две категории образцов с овуляцией и без овуляции. Способность переобученной модели MobileNet предсказывать правильный результат оценивалась с использованием 100 изображений с паттернами папоротника и 100 изображений без паттернов папоротника смоделированной искусственной слюны. Эффективность сети при оценке высушенных на воздухе образцов слюны составила 90% с 95% доверительными интервалами (ДИ), которые варьировались от 84.от 98% до 93,78% (, S5A). Сеть работала с чувствительностью 97,62% (ДИ: от 91,66% до 99,71%) и специфичностью 84,48% (ДИ: 76,59% до 90,54%) (, S5A) при оценке образцов папоротника искусственных образцов слюны. Для данного набора тестов положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) системы составляли 82% (ДИ: от 74,85% до 87,46%) и 98% (ДИ: 92,56% до 99,48%) соответственно ( , С5А). График t-SNE был создан для визуализации степени разделимости данных в двумерном пространстве ().Между двумя образцами наблюдалась хорошая степень разделения.

(A) Точечный график иллюстрирует эффективность системы при оценке высушенных на воздухе образцов искусственной слюны (n = 200). (B) График иллюстрирует производительность системы при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека (n = 200). Квадраты представляют собой истинные метки, а кружки внутри них представляют собой классификацию системы.Синие квадраты и кружки представляют образцы слюны без овуляции, а красные квадраты и кружки представляют образцы слюны с овуляцией. (C) Диаграмма рассеивания помогает визуализировать разделение овулирующих и неовулирующих образцов на основе структур папоротника, представленных высушенными на воздухе образцами искусственной и человеческой слюны. Карта заметности была извлечена из сети, чтобы выделить наиболее взвешенные функции изображения. Черный цвет обозначает функции с наименьшим весом, а белый цвет указывает на функции с наибольшим весом на изображении.

Работа системы с человеческой слюной

Мы также оценили способность системы различать овулирующие и неовулирующие образцы человеческой слюны. Женщины (n = 6) собирали и тестировали образцы своей слюны с помощью системы мобильного телефона во время овуляционной и неовуляционной фаз менструального цикла, и результаты были подтверждены с помощью анализа мочи Clear Blue ^® (LH + эстроген). Испытуемых просили плюнуть на резервуар микрофлюидного устройства и намазать его на микроканал для просушки воздухом.Используя дополнительные 748 аннотированных изображений образцов слюны человека, состоящих из 108 изображений с овуляцией и 640 изображений без овуляции, полученных от субъектов (n = 6), мы переобучили и проверили разработанную нейронную сеть. Вся сеть была обучена 4000 тренировочным шагам со скоростью обучения 0,01, при использовании которой были достигнуты самые низкие проверочные веса. На 1000 ^-м шаге обучения перекрестная энтропия проверки составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45%. На 4000 ^-м -м шаге обучения мы заметили, что точность осталась неизменной без снижения перекрестной энтропийной потери.Между кривыми точности обучения и проверки была небольшая предельная разница, указывающая на то, что модель не была переоснащена (). Способность переобученной модели MobileNets предсказывать правильный результат оценивалась с использованием набора из 100 изображений с узорами папоротника и 100 изображений без узоров папоротника. Точность нейронной сети в прогнозировании образца слюны как овулирующей и неовулирующей составила 99,5% с ДИ в диапазоне от 97,25% до 99,99% (, S5B). Чувствительность и специфичность системы смартфонов с искусственным интеллектом при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека составила 99.01% (ДИ: от 94,61% до 99,97%) и 100% (ДИ: 96,34% до 100%) соответственно (, S5B). Мы выполнили t-SNE, чтобы визуализировать разделение набора данных сетью в 2D-пространстве (). Увидев отличное разделение между двумя классами, мы дополнительно исследовали сеть, сопоставив последние слои активации, чтобы визуализировать значимость. С помощью карт заметности ³⁴ мы смогли определить пиксели, которые используются сетью, и подтвердили, что она сосредоточилась на функциях, относящихся к шаблону папоротника в процессе принятия решений ().PPV и NPV системы для данного тестового набора составили 100% и 99,0% (ДИ: от 93,37% до 99,86%) соответственно.

Адаптируемость системы к различным смартфонам

Чтобы оценить возможность обобщения разработанного алгоритма искусственного интеллекта на устройства и системы визуализации, мы протестировали высушенные на воздухе образцы искусственной слюны с различными концентрациями аналитов, представляющих фазы овуляции и неовуляции, с использованием 5 разных смартфонов. В этом исследовании мы использовали Samsung Galaxy 5, Xiaomi Redmi Note 4, OnePlus 5T, LG G6 и Moto X.Использовался базовый алгоритм, обученный как на изображениях воздушно-сухих образцов искусственной слюны, так и на образцах слюны человека, полученных с помощью устройства Moto X, и никакого дополнительного обучения для адаптации сети к тестируемым устройствам не проводилось. Сеть работала с отличной согласованностью на всех протестированных устройствах, получив отличную оценку 1,0 (нижний 95% ДИ: 1,0) в альфа-тесте Кронбаха на согласованность (n = 15 с 5 телефонами) (таблица S2). Эти результаты показывают, что разработанная сеть хорошо обобщается для различных смартфонов, протестированных в этом исследовании.

Обсуждение

Точное определение овуляции полезно при планировании семьи. Текущий домашний тест мочи выявляет внезапный всплеск ЛГ, что помогает определить фазу овуляции. Хотя ЛГ в моче легко проверить, люди из менее развитых стран не имеют доступа к этим относительно дорогим наборам для тестирования. Кроме того, тест на папоротник может быть более надежным у пациенток с ложноположительными реакциями на набор для определения ЛГ в моче, например у женщин с синдромом поликистозных яичников и повышенным уровнем ЛГ.В настоящее время тесты слюнного папоротника проводятся с использованием капли подъязычного образца слюны, помещенной на предметное стекло, которую затем сушат и вручную тестируют на папоротниковые структуры ³⁵ . Ручное тестирование очень субъективно и может привести к неправильной интерпретации результатов неспециалистами.

Мы разработали автоматизированную оптическую систему на базе смартфона, которая может точно определять овуляцию у женщин, используя небольшой объем (<100 мкл) высушенных на воздухе образцов слюны, загруженных в микрофлюидное устройство, посредством обнаружения папоротника слюны с помощью анализа на основе искусственного интеллекта по телефону. .Наше микрожидкостное устройство обеспечивает быстрое (<7 минут) высыхание образца слюны за счет создания тонких пленок и обеспечивает контролируемый объем образца для анализа. Традиционные методы точечного размещения не контролируют объем образца и, таким образом, часто имеют тенденцию вызывать ложный сигнал.

Хотя контроль объема образца слюны достигается в микрожидкостном устройстве, мы заметили, что узоры папоротника не одинаково распространены по всему микроканалу, а обнаруживаются в виде пакетов. Вероятно, это связано с перераспределением растворенного вещества в микрофлюидном устройстве во время формирования тонких пленок в сочетании с неравномерным испарением. В таком случае для точного предсказания узоров папоротника мы визуализировали весь микроканал, чтобы убедиться, что все узоры папоротника на микрофлюидном устройстве были захвачены и проанализированы. Точность системы при классификации образцов слюны и обнаружении структур папоротника в неразбавленных, необработанных образцах слюны составила 99,5% (). Оптический фокус и равномерная интенсивность света были зафиксированы в оптической системе, чтобы избежать ошибок ручной настройки.

Разработанная система визуализации может быть использована для других приложений, которые включают визуализацию микроструктур в освещенной среде, например, для обнаружения структур папоротника в амниотической жидкости для диагностики преждевременного разрыва плодных оболочек (PROM) у беременных женщин ³⁶ и слезной пленки для обнаружения болезнь сухого глаза ³⁷ .Разрыв плодных оболочек (ПЗУ) – разрыв амниотического мешка, происходящий до начала родов ³⁶ . С другой стороны, болезнь сухого глаза диагностируется путем проверки глазной слезной пленки на наличие узоров папоротника. Образцы здоровой слезы образуют плотные узоры папоротника, которые отсутствуют в образцах сухого глаза ³⁷ .

Экспресс-тест на овуляцию по месту оказания медицинской помощи также имеет важное применение в животноводстве. Разведение животных в основном зависит от цикла размножения вида и ограничено во времени.Одним из важных критериев разведения животных является определение оптимального времени разведения животного для достижения более высокой степени оплодотворяемости. Для яйцеклетки, оплодотворенной в более позднем возрасте, шансы на аборт выше. Поэтому существует необходимость в расширенном прогнозировании овуляции. Разработанная автоматизированная оптическая система на основе смартфона потенциально может быть использована для анализа моделей выделения слюны у животных, таких как буйволы ³⁸ , собаки ³⁹ и других млекопитающих, для прогнозирования и подтверждения их овуляции и определения оптимального времени осеменения.Чтобы определить время осеменения, многие заводчики животных полагаются на ручные методы, такие как индикация охоты, но это не всегда точно; овуляция может происходить до, во время или после видимой течки ⁴⁰ . Другие устройства, такие как электронные шагомеры или метки активности, используются для обнаружения овуляции путем отслеживания изменений в поведении, таких как беспокойство, стоячая течка, поведение вскакивания и повышенная физическая активность животных ⁴¹ . Некоторые животные чувствительны к этим типам измерений, и животноводам становится трудно проверять их с помощью этих методов.Чтобы исключить такие осложнения, необходима регулярная, доступная и удобная система определения овуляции для эффективного управления разведением животных.

Одним из основных преимуществ указанного подхода по сравнению со всеми другими доступными методами является его экономическая эффективность в долгосрочной перспективе ¹⁰ . Общая стоимость материала для нашего подхода составляет ~ 14 долларов США, и его можно полностью использовать повторно. Тесты на основе мочи могут стоить от 1 до 2 долларов за тест, однако они не подлежат повторному использованию, и, таким образом, за цикл общий тест может стоить примерно 35-40 долларов для пользователя в США. Согласно предыдущим отчетам, большинство женщин беременеют в течение 6 циклов, поэтому, по нашим оценкам, эти одноразовые тесты могут в совокупности стоить более 200 долларов США для большинства женщин ⁴² . Следует отметить, что прямое сравнение затрат, связанных с анализами мочи и тестированием слюны на основе ИИ, ограничено, поскольку заявленные нами материальные затраты не включают затраты, связанные с коммерциализацией продукта и каналами сбыта. Кроме того, поскольку он выполняет весь необходимый анализ на телефоне без необходимости в Интернете, он особенно привлекателен для использования в условиях ограниченных ресурсов.

Одним из ограничений разработанной оптической системы на базе смартфона является обнаружение овуляции у женщин с дисбалансом эстрогенов, кистами в яичниках и у тех, кто принимает лекарства от бесплодия. Кроме того, после курения или употребления алкоголя следует обеспечить достаточный промежуток времени перед тестированием. Если на эти состояния не обращать должного внимания, они могут вызвать папоротникообразные структуры при отсутствии овуляции. Наша система может определить все фертильное окно, включая точный день овуляции, когда шансы на зачатие выше.Кроме того, включение базальной температуры тела может помочь в преодолении текущих ограничений системы и, таким образом, требует дальнейших исследований. Продемонстрированная здесь работа является примером того, как искусственный интеллект, интегрированный со смартфонами вместе с недорогим оборудованием, может быть преобразован в эффективный диагностический анализ по месту оказания медицинской помощи, который может удовлетворить потребность в домашнем управлении фертильностью и планировании семьи.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Снеху Сундар и Фенила Доши за продуктивные обсуждения.Эта работа частично поддерживается экспериментальным грантом Исследовательского института Бригама, Инновационным вечнозеленым фондом (Исследовательский институт Бригама, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа), 1R01AI118502 и P30ES000002, R21HD092828 (Национальный институт здравоохранения) и Гарвардским национальным институтом гигиены окружающей среды. Научный грант (Гарвардская школа общественного здравоохранения им. Т. Х. Чана, Гарвардский центр гигиены окружающей среды) и Премия Американского общества репродуктивной медицины (Американский совет акушерства и гинекологии, Американский колледж акушеров и гинекологов, Американское общество репродуктивной медицины и Общество Репродуктивная эндокринология и бесплодие).

Сноски

Конфликт интересов

У авторов нет конфликтов интересов, о которых следует заявить.

Ссылки

Недорогое устройство на базе смартфона для тестирования овуляции по месту оказания медицинской помощи

Лабораторный чип. Авторская рукопись; Доступно в PMC 2019 18.

Опубликовано в окончательной редактированной форме AS:

PMCID: PMC6321627

NIHMSID: NIHMS1001781

8 Vaishnavi Potluri

¹ Инженерное отделение в медицине, Медицинский факультет, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Хемант Кандула

¹ Инженерно-техническое отделение медицины, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бост on, MA, USA

Prudhvi Thirumalaraju

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Manoj Kumar Kanakasabapathy

1^{4 Инженерное дело в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Сандип Кота Сай Паван

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардский медицинский университет Школа, Бостон, Массачусетс, США

Дивьянк Ярраварапу

¹ Инженерно-техническое отделение Медицинского факультета, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Ананд Сундарараджан

^{5 Отделение 1 инженерии в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Ka Ртик Баскар

¹ Инженерное отделение медицины, Медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Neeraj Gudipati

¹ Инженерное отделение медицины, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

John С.

Petrozza

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Больница общего профиля Массачусетса, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США , Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Медицинский факультет, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

¹ Инженерное отделение в медицине, Женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Массачусетская больница общего профиля, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Отделение Медицина, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

^# Внесли равный вклад.

Авторские взносы

H.S. и М.К.К. спроектировал исследование. П.В. и П.С.К. провел эксперименты и оптимизировал показания теста. М.К.К консультировал и помогал в экспериментальном процессе. Дж.Ч.П., А.С. и К.Б. помогали собирать образцы у испытуемых и проводить эксперименты. Д.Ю., П.Т., Х.К. и С.К.С.П. спроектировал устройство и выполнил его изготовление, а также оказал помощь в исследованиях по оптимизации устройства. П.В. и П.С.К. разработал микрожидкостное устройство для работы с образцами.Х.К. и Р.Г. разработали код смартфона для обнаружения структуры папоротника и разработали графический пользовательский интерфейс приложения для смартфона. Н.Г. помог в разработке кода смартфона. П.В. и П.С.К. проанализировали данные, а М.К.К. дал рекомендации по анализу данных. J.C.P. обеспечена клиническая поддержка и материально-техническое обеспечение. П.В., П.С.К., М.К.К. и Х.С. написал рукопись. Все авторы отредактировали рукопись. Окончательная отредактированная версия этой статьи доступна в Lab Chip См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Возможность точного прогнозирования овуляции в домашних условиях с помощью недорогой диагностики в месте оказания медицинской помощи может оказаться существенной помощью для пар, предпочитающих естественное планирование семьи. Обнаружение гормонов, специфичных для овуляции, в образцах мочи и мониторинг базальной температуры тела в настоящее время являются общепринятыми домашними методами, используемыми для обнаружения овуляции; однако эти методы относительно дороги для длительного использования, а результаты трудно понять. Здесь мы сообщаем об устройстве на базе смартфона для автоматизированного тестирования овуляции с использованием искусственного интеллекта (ИИ) путем обнаружения узоров папоротника в небольшом объеме (<100 мкл) слюны, высушенной воздухом на микрофлюидном устройстве.Мы оценили работу устройства с использованием образцов искусственной слюны и слюны человека и обнаружили, что устройство показало точность >99% в эффективном прогнозировании овуляции.

Graphical Abstract

Недорогой, быстрый, автоматизированный микрочип на базе смартфона для тестирования овуляции путем обнаружения структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны с использованием искусственного интеллекта.

Введение

Планирование семьи укрепляет права людей определять количество детей и интервалы между их рождением.Время полового акта по отношению к овуляции сильно влияет на вероятность успешного зачатия и может быть эффективным методом естественного планирования семьи ¹ . Почти 44% всех беременностей во всем мире являются незапланированными или непреднамеренными ^{2, 3} . Непреднамеренная беременность может иметь неблагоприятные последствия для здоровья как матери, так и ребенка и сопряжена со значительным экономическим и социальным бременем. Кроме того, только в 2010 году расходы на роды, аборты и выкидыши в результате незапланированной беременности составили более 21 миллиарда долларов государственных средств в США ^{4, 5} .Исследование также показало, что услуги по планированию семьи сами по себе помогли снизить число нежелательных беременностей и связанные с этим расходы почти на 70% ^{5, 6} . Простой недорогой инструмент, который может помочь в планировании семьи, поможет женщинам избежать нежелательной беременности и будет иметь большое значение для тех пациенток, которые пытаются зачать ребенка.

Естественное планирование семьи использует физические признаки, симптомы и физиологические изменения для прогнозирования фертильности женщины ^{7, 8} . Некоторые из методов мониторинга женской фертильности включают обнаружение овуляции посредством определения уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ), оценку активности бета-глюкуронидазы в слюне, ректальный или оральный анализ базальной температуры тела, характеристику цервикальной слизи и анализ слюнного папоротника ⁹ .Анализ слюнных папоротников относительно недорог и прост, что делает его привлекательной альтернативой большинству доступных подходов ¹⁰ . Во время фолликулярной фазы менструального цикла с повышением уровня эстрадиола в крови происходит увеличение электролитов слюны, что приводит к стойкому папоротниковому виду, кристаллизованной структуре, напоминающей листья папоротника, в высушенной на воздухе слюне и может быть использовано для определить период овуляции ^{10, 11} . Структуры папоротника наблюдались у овулирующих женщин в течение 4-дневного окна около дня овуляции ¹² .Тем не менее, современные тесты на овуляцию, основанные на слюнном папоротнике, являются ручными и очень субъективными, что вызывает неправильную интерпретацию, когда их выполняет непрофессиональный потребитель ¹³ .

Искусственный интеллект (ИИ) получает признание в медицине, и одним из основных его применений в здравоохранении является его способность точно интерпретировать сложные медицинские данные со сверхчеловеческой точностью и последовательностью ¹⁴ . Уже было показано, что ИИ исключительно хорошо работает в таких приложениях, как прогнозирование риска сердечно-сосудистых заболеваний ¹⁵ , скрининг рака кожи ¹⁶ и обнаружение диабетической ретинопатии ¹⁷ .Достижения в области микроэлектроники и машинного обучения позволили современным методам, основанным на искусственном интеллекте, одинаково хорошо работать на портативных системах, особенно на смартфонах. Смартфонами пользуются более 4,4 миллиарда человек по всему миру, что делает их отличным кандидатом на разработку технологий для оказания медицинской помощи ¹⁸ . Фактически, камеры смартфонов использовались в тестах по месту оказания медицинской помощи как для качественного, так и для количественного определения клинически значимых биомаркеров для выявления заболеваний или мониторинга лечения, таких как выявление ВИЧ/СПИДа и сифилиса ^19–21 , герпеса ²² , серповидноклеточная анемия ²³ , мужское бесплодие ^24–29 и Зика ^{30, 31} .

Здесь мы сообщаем о простом, недорогом и автоматизированном устройстве на базе смартфона для тестирования овуляции по месту оказания медицинской помощи, которое использует искусственный интеллект для точного обнаружения паттернов папоротника в небольшом объеме (~ 100 мкл) воздушно-сухой слюны. образцы помещают на микрожидкостное устройство (). Мы использовали нейронную сеть для быстрого (менее 31 секунды) анализа и обнаружения папоротников в высушенных на воздухе образцах слюны. Нейронная сеть использует архитектуру MobileNet, предварительно обученную на 1,4 миллионах изображений ImageNet и повторно обученную на изображениях слюнных папоротников.Устройство на базе смартфона смогло определить овуляцию с точностью 99,5% при тестировании 200 изображений человеческой слюны, собранных во время овуляционных и неовуляционных фаз менструального цикла у 6 женщин.

Этапы проведения теста слюнного папоротника на основе смартфона.

(A) Слюну собирают на микрожидкостном устройстве, смазывают тампоном и оставляют для сушки на воздухе. (B) Оптическая система подключена к совместимому смартфону для тестирования.(C) Микрожидкостное устройство с высушенным на воздухе образцом вставляется в оптическую насадку, и тест инициализируется с помощью разработанного пользовательского приложения для Android. (D) Программное обеспечение анализирует образец папоротника, демонстрируемый высушенными на воздухе образцами слюны, и определяет, находится ли субъект в овуляционной или неовуляционной фазе менструального цикла.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Целью данного исследования была разработка автоматизированного устройства для определения овуляции у женщин с помощью теста слюнного папоротника.В исследовании приняли участие 6 здоровых женщин в возрасте от 20 до 22 лет. Субъекты были отобраны на основе следующих критериев: 1) у них в анамнезе были нормальные менструальные циклы; 2) Они не употребляли табак и алкоголь и 3) Они не использовали гормональную контрацепцию в течение периода исследования. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Набранные субъекты предоставили информированное согласие до сбора образцов слюны.Каждому испытуемому давали микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл для сбора образца рано утром перед чисткой зубов. Образцы слюны собирали во время овуляционных и неовуляционных фаз. Две различные фазы были идентифицированы с использованием теста мочи Clear Blue ^® (ЛГ + эстроген) в качестве эталона. Образцы загружали в микрожидкостное устройство и анализировали с помощью оптической системы на базе смартфона. Также был проведен ручной анализ на наличие слюнного папоротника с использованием микроскопа на этапе обучения сети.

Оптическая насадка

Для проведения этого исследования мы разработали оптическую насадку для смартфона (83 × 97 × 74 мм), которая была напечатана на 3D-принтере с помощью Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и полимолочной кислоты (PLA) (Ultimaker). печатный материал (). Оптическая схема прибора содержала плосковыпуклую линзу диаметром 9 мм с фокусным расстоянием 13,5 мм для увеличения и стандартную акриловую линзу диаметром 12 мм с фокусным расстоянием 30 мм в качестве конденсора. Объективы были совмещены с оптической осью фронтальной камеры смартфона.Насадка была разработана в SolidWorks (Dassault Systèmes) для смартфона Moto X (Motorola, XT1575). Движение микрофлюидного устройства по оси X (параллельно установке линзы) было достигнуто с помощью редукторного двигателя постоянного тока 6 В, 100 об / мин (B07556CZL1, Walfront) с ходовым винтом M3, прикрепленным к валу. Устройство питалось от щелочной батареи 9 В (B000099SKB, Energizer). Для освещения микрофлюидного чипа использовали рассеянный белый светоизлучающий диод (LED) 5 В (IL153, ​​Microtivity). Одноплатный микроконтроллер (NodeMCU) использовался для управления движением микрожидкостного устройства.Принципиальная схема установки приведена в дополнительной информации (рис. S1).

Схематическое изображение оптической системы на базе смартфона и одноразового микрожидкостного устройства.

(A) Покомпонентное изображение автономной оптической системы и ее различных компонентов. Система управляется по беспроводной связи с помощью смартфона для отображения структур папоротника на микрофлюидном устройстве. (B) Фактическое изображение изготовленной автономной оптической системы со смартфоном для визуализации и анализа структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны.(C) Взрыв микрофлюидного устройства с блоком мазка. (D) Фактическое микрожидкостное устройство, помещенное рядом с монетой в четверть доллара США.

Изготовление микрожидкостных устройств

Микрожидкостное устройство состояло из поли(метилметакрилата) (ПММА) (8560K239, McMaster Carr), двустороннего клея (DSA), полимолочной кислоты (PLA) и предметного стекла (VWR, 48300–025). Corning 75×25 мм). Прозрачные листы PMMA и DSA вырезали с помощью лазерного резака (VLS 2.3, Universal Laser Systems Inc.). Лазерный резак также использовался для контролируемого травления ПММА для создания канавок. Канавки были протравлены на ПММА таким образом, чтобы внутренняя сторона полностью построенного микрофлюидного чипа служила направляющими для блока мазка. Небольшой участок (25 × 12 мм ² ) был оставлен открытым на одном конце предметного стекла для работы с микрожидкостным устройством (). Одна сторона DSA была приклеена к протравленной стороне канавки ПММА, а другая сторона была приклеена к предметному стеклу, которое использовалось в качестве нижней подложки для микрочипа.Мазковый блок (12 × 8 × 9,6 мм) был напечатан с использованием 3D-принтера Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и PLA в качестве материала для печати. Блок мазка использовался для смазывания образца внутри канала (40 × 5 мм ² ) микрожидкостного устройства для получения контролируемой тонкой пленки слюны. Микрожидкостное устройство также имело небольшой резервуар для загрузки образца на чипе.

Приложение для Android

Приложение для Android было разработано для сбора данных изображений с помощью оптической насадки смартфона и анализа узоров папоротника, присутствующих в высушенной воздухом слюне, для прогнозирования статуса овуляции.Когда микрофлюидное устройство с загруженным образцом было вставлено в оптическую насадку, микрофлюидное устройство перемещалось параллельно установке линзы для автоматического изображения всего канала слюнного папоротника. Приложение для Android управляло двигателями через NodeMCU и, следовательно, движением микрофлюидного устройства. Беспроводная связь между смартфоном и оптической системой была достигнута за счет настройки NodeMCU в качестве веб-сервера HTTP. Приложение захватывает видеокадры микроканала со скоростью ~ 5 кадров в секунду (fps).

Видеокадры были отобраны с 4-кратным увеличением, и каждый кадр был передан в обученную сеть для обнаружения присутствия папоротника. Время вывода для получения результата для каждого кадра составило ~200 мс для смартфона Moto X и может различаться для разных смартфонов. Пользовательский интерфейс приложения для смартфона был разработан, чтобы быть простым и удобным в использовании. Кроме того, результаты сохранялись в календарном событии для отслеживания цикла овуляции. Приложение для Android автоматически захватывает видеокадры, локально анализирует изображения и сообщает результат менее чем за 31 с.Для анализа не требуется доступ в интернет.

Сбор данных

Добровольных участников попросили собрать образцы слюны рано утром перед чисткой зубов, чтобы исключить любые расхождения в концентрации электролитов в слюне из-за повседневной деятельности человека. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Мы собирали образцы каждый день у каждой участницы в течение одного полного менструального цикла и тестировали их с помощью наших микрожидкостных устройств как во время овуляционной, так и неовуляционной фаз.Мы также использовали искусственную слюну для имитации узоров папоротника для обучения и тестирования алгоритма ИИ. Мы смоделировали 30 неовулирующих образцов в диапазоне от 0,1% до 1,4% и 34 овулирующих образца в диапазоне от 5,6% до 100% запаса искусственной слюны. Образцы были подготовлены, чтобы охватить широкий спектр папоротниковых и непапоротниковых структур. Подготовленные образцы загружали в микрожидкостные устройства и размазывали по узкому каналу с помощью размазывающего блока. Образцы высушенной на воздухе слюны затем визуализировались с помощью оптической системы на базе смартфона.Всего было получено 1640 изображений из образцов слюны человека и искусственной слюны, которые были классифицированы на 476 изображений с овуляцией и 1164 изображения без овуляции на основе паттернов папоротника. Аннотации для образцов с папоротником и без папоротника были получены путем ручного осмотра смоделированных образцов под настольным микроскопом. Статус овуляции для образцов человеческой слюны был установлен с помощью анализа мочи (ЛГ + эстроген) в дополнение к ручной проверке.

Обучение MobileNet

Чтобы классифицировать структуры папоротника на смартфоне, MobileNet предварительно обучен 1.В качестве архитектуры нашей нейронной сети ³² использовалось 4 миллиона изображений ImageNet с параметром множителя ширины α=0,50 и размером изображения 224×224 пикселя. ImageNet, набор данных с открытым исходным кодом, который содержит изображения без слюны из различных категорий, помог в предварительном обучении сети. Для сложной архитектуры нейронной сети, такой как MobileNet, набора данных примерно из 1500 изображений недостаточно для оптимизации их весов во время обучения. Поэтому мы использовали разнообразный крупномасштабный набор данных, чтобы «предварительно обучить» сеть, а затем уточнить ее, чтобы она работала для нашего приложения для анализа слюнных папоротников. Используемая модель MobileNet работала с точностью 1 первого уровня 64,0% и точностью 5 топового уровня 85,4 % по 1000 классам базы данных ImageNet.

MobileNet был специально разработан для эффективного использования ограниченных ресурсов, доступных на встроенных устройствах, таких как смартфоны. Сеть использует свертки с разделением по глубине для построения облегченных глубоких нейронных сетей, в отличие от традиционных нейронных сетей свертки, которые используют стандартную двумерную свертку. Стандартная двумерная свертка применяет ядро ​​свертки ко всем каналам входного изображения.2D-свертка перемещает ядра по всем каналам входного изображения и вычисляет взвешенную сумму входных пикселей, применяемых ядром для всех входных каналов. Глубинная свертка — это пространственная разделимая свертка, выполняемая на отдельных каналах, выходные данные которой вычисляются в новый канал с помощью точечной свертки (стандартная свертка с ядром 1×1).

Структуры MobileNet были построены с помощью разделимых по глубине сверток, за исключением первого слоя, который был построен со стандартной сверткой 3×3. За каждым сверточным слоем следует выпрямленная линейная единица (ReLU) и нормализация партии. Последний уровень MobileNet содержит средний объединяющий слой для уменьшения пространственного разрешения до 1, за которым следует полносвязный слой, который был передан на наш уровень классификации для обнаружения. Выборка вниз выполнялась с помощью шаговой свертки в свертках по глубине, а также в первом слое. Вместо обучения модели с нуля была использована техника трансферного обучения. Мы использовали предварительно обученные веса MobileNet, который был обучен на ImageNet для повторного использования его возможностей извлечения признаков.Слой классификации был добавлен в конце и был обучен классифицировать образцы слюны на овулирующие и неовулирующие на основе шаблонов папоротника. Только классификационный слой был обучен, а остальные слои остались нетронутыми. Выходные данные полностью подключенного слоя оставались одинаковыми для каждого изображения, и выходные данные использовались несколько раз. Поскольку расчет результатов занимал значительное время, мы создали узкие места на выходе, чтобы сократить время обучения. Выходные данные полносвязного слоя использовались в качестве входных данных для слоя классификации.Истинные метки передавались в сеть как наземные, и вычислялись точность, перекрестная энтропия и градиенты ().

Графическое изображение потока данных с обучающими и проверочными кривыми для точности и перекрестной энтропии.

(A) Вычислительный поток данных. (B) Набор данных папоротниковых и непапоротниковых изображений был обучен и проверен на более чем 4000 тренировочных шагов со скоростью обучения 0,01. К 4000-му шагу обучения точность проверки и потеря перекрестной энтропии достигли предела.

Эффективность обучения измерялась перекрестной энтропией, которая использовалась в качестве функции потерь, чтобы узнать, насколько хорошо сеть обучается. Точность обучения — это процент правильно помеченных изображений в обучающем пакете, а точность проверки — это процент правильно помеченных изображений, отличных от изображений в обучающем пакете. Разница между двумя точностями использовалась для определения того, является ли модель переоснащением.

Для трансферного обучения мы повторно обучили MobileNet, предварительно обученную на ImageNet, для 4000 обучающих шагов (эпох) со скоростью обучения, установленной на 0.01 с использованием наших наборов данных слюны. Вес модели, достигший наименьшей потери перекрестной энтропии, сохранялся и использовался. На 1000 ^-м шаге обучения потеря перекрестной энтропии при проверке составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45% (). В рамках процесса обучения размеры всех изображений, используемых во время обучения, были изменены до 224×224 пикселей с использованием библиотек компьютерного зрения (OpenCV) и обучены в среде TensorFlow. Обученная таким образом нейронная сеть выполняла всю обработку и анализ локально, без необходимости доступа к Интернету.

Методы визуализации данных

Карты значимости были созданы с использованием TensorFlow. SmoothGrad, примененный к выходным данным, полученным из полносвязного слоя свертки, использовался для повышения резкости карт чувствительности на основе градиента ^{33, 34} . Мы сопоставили активации слоя активации сразу после полносвязного слоя свертки. При создании карт заметности использовались изображения как искусственной слюны, так и изображений тестового набора слюны человека. Встраивание стохастических соседей по t-распределению (t-SNE) было выполнено для наблюдения за распределением набора тестовых данных в 2D-пространстве и для проверки того, способна ли наша модель точно различать овулирующие и неовулирующие образцы.

Искусственная слюна

Искусственная слюна использовалась для имитации папоротников. Состав искусственной слюны следующий: 0,92 г/л ксантановой камеди (Q8185, MP Biomedicals), 1,2 г/л хлорида калия (L1117, Chemcruz), 0,85 г/л хлорида натрия (031M0215V, Sigma), 0,05 г. л хлорида магния (030M0060V, Sigma), 0,13 г/л хлорида кальция (057K0005, Sigma), 0,13 г/л дикалия гидроортофосфата (SLBS6839, Sigma) и 0,35 г/л метил-п-гидроксибензоата (Q7915, MP биомедицинские препараты).рН искусственно приготовленной слюны составлял 7,0. pH нормальных образцов слюны колеблется от 6,2 до 7,6. Мы подготовили исходный раствор и разбавили его деионизированной водой, чтобы имитировать образцы слюны, полученные от овулирующих и неовулирующих людей. Ниже приводится разбивка концентраций искусственной слюны, показывающая три фазы папоротника: непапоротниковый — от 0,1% до 1,4%, переходный — от 1,5% до 5,6% и папоротниковый — от 5,6% до 100% приготовленного запаса искусственной слюны.

Результаты

Характеристика оборудования для анализа овуляции на основе смартфона

Система тестирования овуляции на основе смартфона была разработана таким образом, чтобы быть простой и с минимальным вмешательством пользователя (, ).Аппаратные компоненты системы состояли из оптической насадки для смартфона для увеличения изображения образца и микрожидкостного устройства для работы с образцом слюны (, ). Оптическая насадка для смартфона, напечатанная на 3D-принтере, была легкой (208 г) и компактной (83 × 70 × 74 мм). Он использовал переднюю камеру смартфона для изображения и был прикреплен к телефону с помощью простого надвижного механизма. Увеличение изображения, достигнутое системой смартфона, составило 4×, что было сравнимо с цифровыми изображениями, полученными с помощью стандартного лабораторного микроскопа (Carl Zeiss AG Axio Observer D1) при 10-кратном увеличении.Эффективное поле зрения системы составляло 2,19 × 2,95 мм. Отображая микрометровый масштаб с помощью оптической системы, мы заметили, что 1 мкм на записанном изображении представлен 0,226 пикселями (рис. S2A), однако разрешение оптической системы сотового телефона составляло 7 мкм, что было установлено при отображении изображения 1951 года. Целевое разрешение ВВС США (USAF) (рис. S2B). Система была моторизована вдоль одной оси и фокальной плоскости для автоматизации визуализации микрожидкостного канала. Микрожидкостное устройство, содержащее образец слюны, было оптимально сфокусировано путем размещения устройства на рабочем расстоянии от установки линзы, что помогло исключить ручную фокусировку пользователем.Общая стоимость материала для изготовления аксессуара для смартфона и микрофлюидного устройства составила 13,91 доллара США, включая 13,58 доллара США на оптическую насадку и 0,33 доллара США на микрофлюидное устройство (таблица S1). Приложение для смартфона было разработано, чтобы направлять пользователя на каждом этапе тестирования (рис. S3). Разработанная система записывала видео со скоростью ~ 5 кадров в секунду, покрывая площадь 2,1 × 22,6 мм ² микрофлюидного устройства за <31 секунду на образец, в течение которых приложение для смартфона отображало, локально анализировало и сообщало результат.

Микрожидкостное устройство для работы с образцами

Микрофлюидное устройство было разработано с резервуаром для загрузки образца слюны и узким микроканалом для визуализации воздушно-сухого образца. Образец слюны наносится на зону визуализации устройства с помощью простого накладного блока, напечатанного на 3D-принтере ()

. Среднее время высыхания образца слюны на микрожидкостном устройстве составило 6,7 ± 1,5 минуты по сравнению с минимальными 25 минутами. на обычном предметном стекле (n=8, по 3 повторности) (рис.С4). Был проведен регрессионный анализ методом наименьших квадратов, и наклоны линий для микрожидкостных устройств и групп предметных стекол составили 0,008 (95% доверительный интервал: от -0,003 до 0,02) и 0,52 (95% доверительный интервал: 0,29 до 0,74) со значениями R ² 0,30 и 0,97 соответственно (рис. S4). При размазывании образца создается тонкая пленка на стеклянной подложке микрофлюидного устройства, что минимизирует время высыхания образца независимо от его объема.

Работа системы в искусственной слюне

Образцы искусственной слюны использовались для обучения нейронной сети.Используя 492 аннотированных изображения, состоящих из 168 изображений с узорами папоротника и 324 изображений без узоров папоротника, мы переобучили и проверили нашу модель для классификации изображений на две категории образцов с овуляцией и без овуляции. Способность переобученной модели MobileNet предсказывать правильный результат оценивалась с использованием 100 изображений с паттернами папоротника и 100 изображений без паттернов папоротника смоделированной искусственной слюны. Эффективность сети при оценке высушенных на воздухе образцов слюны составила 90% с 95% доверительными интервалами (ДИ), которые варьировались от 84.от 98% до 93,78% (, S5A). Сеть работала с чувствительностью 97,62% (ДИ: от 91,66% до 99,71%) и специфичностью 84,48% (ДИ: 76,59% до 90,54%) (, S5A) при оценке образцов папоротника искусственных образцов слюны. Для данного набора тестов положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) системы составляли 82% (ДИ: от 74,85% до 87,46%) и 98% (ДИ: 92,56% до 99,48%) соответственно ( , С5А). График t-SNE был создан для визуализации степени разделимости данных в двумерном пространстве ().Между двумя образцами наблюдалась хорошая степень разделения.

Производительность системы с образцами искусственной и человеческой слюны вместе с визуализацией TSNE.

(A) Точечный график иллюстрирует эффективность системы при оценке высушенных на воздухе образцов искусственной слюны (n = 200). (B) График иллюстрирует производительность системы при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека (n = 200). Квадраты представляют собой истинные метки, а кружки внутри них представляют собой классификацию системы.Синие квадраты и кружки представляют образцы слюны без овуляции, а красные квадраты и кружки представляют образцы слюны с овуляцией. (C) Диаграмма рассеивания помогает визуализировать разделение овулирующих и неовулирующих образцов на основе структур папоротника, представленных высушенными на воздухе образцами искусственной и человеческой слюны. Карта заметности была извлечена из сети, чтобы выделить наиболее взвешенные функции изображения. Черный цвет обозначает функции с наименьшим весом, а белый цвет указывает на функции с наибольшим весом на изображении.

Работа системы с человеческой слюной

Мы также оценили способность системы различать овулирующие и неовулирующие образцы человеческой слюны. Женщины (n = 6) собирали и тестировали образцы своей слюны с помощью системы мобильного телефона во время овуляционной и неовуляционной фаз менструального цикла, и результаты были подтверждены с помощью анализа мочи Clear Blue ^® (LH + эстроген). Испытуемых просили плюнуть на резервуар микрофлюидного устройства и намазать его на микроканал для просушки воздухом.Используя дополнительные 748 аннотированных изображений образцов слюны человека, состоящих из 108 изображений с овуляцией и 640 изображений без овуляции, полученных от субъектов (n = 6), мы переобучили и проверили разработанную нейронную сеть. Вся сеть была обучена 4000 тренировочным шагам со скоростью обучения 0,01, при использовании которой были достигнуты самые низкие проверочные веса. На 1000 ^-м шаге обучения перекрестная энтропия проверки составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45%. На 4000 ^-м -м шаге обучения мы заметили, что точность осталась неизменной без снижения перекрестной энтропийной потери.Между кривыми точности обучения и проверки была небольшая предельная разница, указывающая на то, что модель не была переоснащена (). Способность переобученной модели MobileNets предсказывать правильный результат оценивалась с использованием набора из 100 изображений с узорами папоротника и 100 изображений без узоров папоротника. Точность нейронной сети в прогнозировании образца слюны как овулирующей и неовулирующей составила 99,5% с ДИ в диапазоне от 97,25% до 99,99% (, S5B). Чувствительность и специфичность системы смартфонов с искусственным интеллектом при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека составила 99.01% (ДИ: от 94,61% до 99,97%) и 100% (ДИ: 96,34% до 100%) соответственно (, S5B). Мы выполнили t-SNE, чтобы визуализировать разделение набора данных сетью в 2D-пространстве (). Увидев отличное разделение между двумя классами, мы дополнительно исследовали сеть, сопоставив последние слои активации, чтобы визуализировать значимость. С помощью карт заметности ³⁴ мы смогли определить пиксели, которые используются сетью, и подтвердили, что она сосредоточилась на функциях, относящихся к шаблону папоротника в процессе принятия решений ().PPV и NPV системы для данного тестового набора составили 100% и 99,0% (ДИ: от 93,37% до 99,86%) соответственно.

Адаптируемость системы к различным смартфонам

Чтобы оценить возможность обобщения разработанного алгоритма искусственного интеллекта на устройства и системы визуализации, мы протестировали высушенные на воздухе образцы искусственной слюны с различными концентрациями аналитов, представляющих фазы овуляции и неовуляции, с использованием 5 разных смартфонов. В этом исследовании мы использовали Samsung Galaxy 5, Xiaomi Redmi Note 4, OnePlus 5T, LG G6 и Moto X.Использовался базовый алгоритм, обученный как на изображениях воздушно-сухих образцов искусственной слюны, так и на образцах слюны человека, полученных с помощью устройства Moto X, и никакого дополнительного обучения для адаптации сети к тестируемым устройствам не проводилось. Сеть работала с отличной согласованностью на всех протестированных устройствах, получив отличную оценку 1,0 (нижний 95% ДИ: 1,0) в альфа-тесте Кронбаха на согласованность (n = 15 с 5 телефонами) (таблица S2). Эти результаты показывают, что разработанная сеть хорошо обобщается для различных смартфонов, протестированных в этом исследовании.

Обсуждение

Точное определение овуляции полезно при планировании семьи. Текущий домашний тест мочи выявляет внезапный всплеск ЛГ, что помогает определить фазу овуляции. Хотя ЛГ в моче легко проверить, люди из менее развитых стран не имеют доступа к этим относительно дорогим наборам для тестирования. Кроме того, тест на папоротник может быть более надежным у пациенток с ложноположительными реакциями на набор для определения ЛГ в моче, например у женщин с синдромом поликистозных яичников и повышенным уровнем ЛГ.В настоящее время тесты слюнного папоротника проводятся с использованием капли подъязычного образца слюны, помещенной на предметное стекло, которую затем сушат и вручную тестируют на папоротниковые структуры ³⁵ . Ручное тестирование очень субъективно и может привести к неправильной интерпретации результатов неспециалистами.

Мы разработали автоматизированную оптическую систему на базе смартфона, которая может точно определять овуляцию у женщин, используя небольшой объем (<100 мкл) высушенных на воздухе образцов слюны, загруженных в микрофлюидное устройство, посредством обнаружения папоротника слюны с помощью анализа на основе искусственного интеллекта по телефону. .Наше микрожидкостное устройство обеспечивает быстрое (<7 минут) высыхание образца слюны за счет создания тонких пленок и обеспечивает контролируемый объем образца для анализа. Традиционные методы точечного размещения не контролируют объем образца и, таким образом, часто имеют тенденцию вызывать ложный сигнал.

Хотя контроль объема образца слюны достигается в микрожидкостном устройстве, мы заметили, что узоры папоротника не одинаково распространены по всему микроканалу, а обнаруживаются в виде пакетов. Вероятно, это связано с перераспределением растворенного вещества в микрофлюидном устройстве во время формирования тонких пленок в сочетании с неравномерным испарением. В таком случае для точного предсказания узоров папоротника мы визуализировали весь микроканал, чтобы убедиться, что все узоры папоротника на микрофлюидном устройстве были захвачены и проанализированы. Точность системы при классификации образцов слюны и обнаружении структур папоротника в неразбавленных, необработанных образцах слюны составила 99,5% (). Оптический фокус и равномерная интенсивность света были зафиксированы в оптической системе, чтобы избежать ошибок ручной настройки.

Разработанная система визуализации может быть использована для других приложений, которые включают визуализацию микроструктур в освещенной среде, например, для обнаружения структур папоротника в амниотической жидкости для диагностики преждевременного разрыва плодных оболочек (PROM) у беременных женщин ³⁶ и слезной пленки для обнаружения болезнь сухого глаза ³⁷ .Разрыв плодных оболочек (ПЗУ) – разрыв амниотического мешка, происходящий до начала родов ³⁶ . С другой стороны, болезнь сухого глаза диагностируется путем проверки глазной слезной пленки на наличие узоров папоротника. Образцы здоровой слезы образуют плотные узоры папоротника, которые отсутствуют в образцах сухого глаза ³⁷ .

Экспресс-тест на овуляцию по месту оказания медицинской помощи также имеет важное применение в животноводстве. Разведение животных в основном зависит от цикла размножения вида и ограничено во времени.Одним из важных критериев разведения животных является определение оптимального времени разведения животного для достижения более высокой степени оплодотворяемости. Для яйцеклетки, оплодотворенной в более позднем возрасте, шансы на аборт выше. Поэтому существует необходимость в расширенном прогнозировании овуляции. Разработанная автоматизированная оптическая система на основе смартфона потенциально может быть использована для анализа моделей выделения слюны у животных, таких как буйволы ³⁸ , собаки ³⁹ и других млекопитающих, для прогнозирования и подтверждения их овуляции и определения оптимального времени осеменения.Чтобы определить время осеменения, многие заводчики животных полагаются на ручные методы, такие как индикация охоты, но это не всегда точно; овуляция может происходить до, во время или после видимой течки ⁴⁰ . Другие устройства, такие как электронные шагомеры или метки активности, используются для обнаружения овуляции путем отслеживания изменений в поведении, таких как беспокойство, стоячая течка, поведение вскакивания и повышенная физическая активность животных ⁴¹ . Некоторые животные чувствительны к этим типам измерений, и животноводам становится трудно проверять их с помощью этих методов.Чтобы исключить такие осложнения, необходима регулярная, доступная и удобная система определения овуляции для эффективного управления разведением животных.

Одним из основных преимуществ указанного подхода по сравнению со всеми другими доступными методами является его экономическая эффективность в долгосрочной перспективе ¹⁰ . Общая стоимость материала для нашего подхода составляет ~ 14 долларов США, и его можно полностью использовать повторно. Тесты на основе мочи могут стоить от 1 до 2 долларов за тест, однако они не подлежат повторному использованию, и, таким образом, за цикл общий тест может стоить примерно 35-40 долларов для пользователя в США. Согласно предыдущим отчетам, большинство женщин беременеют в течение 6 циклов, поэтому, по нашим оценкам, эти одноразовые тесты могут в совокупности стоить более 200 долларов США для большинства женщин ⁴² . Следует отметить, что прямое сравнение затрат, связанных с анализами мочи и тестированием слюны на основе ИИ, ограничено, поскольку заявленные нами материальные затраты не включают затраты, связанные с коммерциализацией продукта и каналами сбыта. Кроме того, поскольку он выполняет весь необходимый анализ на телефоне без необходимости в Интернете, он особенно привлекателен для использования в условиях ограниченных ресурсов.

Одним из ограничений разработанной оптической системы на базе смартфона является обнаружение овуляции у женщин с дисбалансом эстрогенов, кистами в яичниках и у тех, кто принимает лекарства от бесплодия. Кроме того, после курения или употребления алкоголя следует обеспечить достаточный промежуток времени перед тестированием. Если на эти состояния не обращать должного внимания, они могут вызвать папоротникообразные структуры при отсутствии овуляции. Наша система может определить все фертильное окно, включая точный день овуляции, когда шансы на зачатие выше.Кроме того, включение базальной температуры тела может помочь в преодолении текущих ограничений системы и, таким образом, требует дальнейших исследований. Продемонстрированная здесь работа является примером того, как искусственный интеллект, интегрированный со смартфонами вместе с недорогим оборудованием, может быть преобразован в эффективный диагностический анализ по месту оказания медицинской помощи, который может удовлетворить потребность в домашнем управлении фертильностью и планировании семьи.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Снеху Сундар и Фенила Доши за продуктивные обсуждения.Эта работа частично поддерживается экспериментальным грантом Исследовательского института Бригама, Инновационным вечнозеленым фондом (Исследовательский институт Бригама, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа), 1R01AI118502 и P30ES000002, R21HD092828 (Национальный институт здравоохранения) и Гарвардским национальным институтом гигиены окружающей среды. Научный грант (Гарвардская школа общественного здравоохранения им. Т. Х. Чана, Гарвардский центр гигиены окружающей среды) и Премия Американского общества репродуктивной медицины (Американский совет акушерства и гинекологии, Американский колледж акушеров и гинекологов, Американское общество репродуктивной медицины и Общество Репродуктивная эндокринология и бесплодие).

Сноски

Конфликт интересов

У авторов нет конфликтов интересов, о которых следует заявить.

Ссылки

1. Wilcox AJ, Weinberg CR and Baird DD, New England Journal of Medicine, 1995, 1517–1521. [PubMed] [Google Scholar]4. Сонфилд А., Хастедт К. и Голд Р.Б. Движение вперед: планирование семьи в эпоху реформы здравоохранения, Институт Гуттмахера, Нью-Йорк, 2014 г. [Google Scholar]5. Сонфилд А. и Кост К., Государственные расходы в связи с незапланированной беременностью и роль программ государственного страхования в оплате медицинских услуг, связанных с беременностью: оценки по стране и штату за 2010 г. , Институт Гуттмахера, Нью-Йорк, 2015 г.[Google Академия]6. Frost JJ, Frohwirth LF and Zolna MR, Contraceptive Needs and Services, Update 2014, Guttmacher Institute, New York, 2016. [Google Scholar]7. Стэнфорд Дж. Б., Лемэр Дж. К. и Турман П. Б., Журнал семейной практики, 1998, 46, 65–71. [PubMed] [Google Scholar]8. Паллоне С.Р. и Бергус Г.Р., Журнал Американского совета семейной медицины: JABFM, 2009, 22, 147–157. [PubMed] [Google Scholar]9. Guida M, Tommaselli GA, Pellicano M, Palomba S и Nappi C, Гинекологическая эндокринология: официальный журнал Международного общества гинекологической эндокринологии, 1997, 11, 203–219.[PubMed] [Google Scholar] 11. Эрсиари Р.М., Вихарджа Р. и Дарджан М., Стоматологический журнал Паджаджаран, 2014, 26, 194–202. [Google Академия] 12. Salmassi A, Schmutzler AG, Püngel F, Schubert M, Alkatout I и Mettler L, Gynecologic and Obstetric Investigation, 2013, 76, 171–176. [PubMed] [Google Scholar] 13. Guida M, Tommaselli GA, Palomba S, Pellicano M, Moccia G, Di Carlo C и Nappi C, Fertility and стерильность, 1999, 72, 900–904. [PubMed] [Google Scholar] 15. Поплин Р., Варадараджан А.В., Блумер К., Лю Ю., МакКоннелл М.В., Коррадо Г.С., Пэн Л. и Вебстер Д.Р., Nature Biomedical Engineering, 2018, 2, 158–164.[Google Академия] 17. Гульшан В., Пэн Л., Корам М., Стамп М.С., Ву Д., Нараянасвами А., Венугопалан С., Виднер К., Мадамс Т., Куадрос Дж., Ким Р., Раман Р., Нельсон П.С., Мега Дж.Л. и Вебстер Д.Р., Джама, 2016, 316 , 2402–2410. [PubMed] [Google Scholar] 18. Jonsson P, Carson S, Sethi JS, Arvedson M, Svenningsson R, Lindberg P, Öhman K and Hedlund P, Ericsson Mobility Report, Ericsson, Стокгольм, Швеция, 2017 г. [Google Scholar]19. Канакасабапати М.К., Пандья Х.Дж., Драз М.С., Чуг М.К., Садасивам М., Кумар С., Этемад Б., Йогеш В., Сафави М., Асгар В., Ли Дж.З., Цибрис А.М., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., Лаборатория на чипе, 2017, 17 , 2910–2919.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]20. Лаксанасопин Т., Го Т.В., Наяк С., Шридхара А.А., Се С., Оловукере О.О., Кадину П., Мэн Ф., Чи Н.Х., Ким Дж., Чин К.Д., Муньязеса Э. , Мугванеза П., Рай А.Дж., Мугиша В., Кастро А.Р., Штайнмиллер Д. , Линдер В., Джастман Дж. Э., Нсанзимана С. и Сиа С. К., Science Translational Medicine, 2015, 7, 273re271. [PubMed] [Google Scholar] 21. Драз М.С., Кочебйоки К.М., Васан А., Батталапалли Д., Шрирам А., Канакасабапати М.К., Каллакури С., Цибрис А., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., Nature Communications, 2018, 9, 4282.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]22. Берг Б., Кортазар Б., Ценг Д., Озкан Х., Фенг С., Вэй К., Чан Р.И.-Л., Бурбано Дж., Фаруки К., Левински М., Ди Карло Д., Гарнер О.Б. и Озкан А., ACS Nano, 2015, 9, 7857 –7866. [PubMed] [Google Scholar] 24. Тирумалараджу П., Борман К.Л., Канакасабапати М., Доши Ф., Сутер И., Димитриадис И. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2018, 110, e432. [Google Академия] 25. Димитриадис И., Сюй Р., Канаксабапати М.К., Тирумалараджу П., Йогеш В., Танрикут С., Хсу Дж., Борман С.Л. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2018, 109, e24.[Google Академия] 26. Канакасабапати М., Тирумалараджу П. , Йогеш В., Натараджан В., Борман К.Л., Петроцца Дж.К. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017 г., 108, e74–e75. [Google Академия] 27. Kanakasabapathy MK, Sadasivam M, Singh A, Preston C, Thirumalaraju P, Venkataraman M, Bormann CL, Draz MS, Petrozza JC and Shafiee H, Science Translational Medicine, 2017, 9. [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Канакасабапати М., Тирумалараджу П., Йогеш В., Натараджан В., Борман К.Л., Бхоумик П., Вейга С., Петроцца Дж.С. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017, 108, e74.[Google Академия] 29. Борман К.Л., Канакасабапати М., Тирумалараджу П., Йогеш В., Натараджан В., Демик Дж., Бланшар А., Петроцца Дж.К. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017, 108, e74. [Google Академия] 30. Драз М.С., Лакшминараасимулу Н.К., Кришнакумар С., Батталапалли Д., Васан А., Канакасабапати М.К., Шрирам А., Каллакури С., Тирумалараджу П., Ли И., Хуа С., Ю К.Г., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., ACS Nano, 2018, 12, 5709 –5718. [Google Академия] 32. Ховард А.Г., Чжу М. , Чен Б., Калениченко Д., Ван В., Вейанд Т., Андреетто М. и Адам Х., ArXiv e-prints, 2017.[Google Академия] 33. Смилков Д., Торат Н., Ким Б., Виегас Ф., Ваттенберг М., Электронные отпечатки ArXiv, 2017. [Google Scholar]34. Симонян К., Ведальди А., Зиссерман А., ArXiv e-prints, 2013. [Google Scholar]35. Гюнтер В., Бауэр И., Хеддерих Дж., Меттлер Л., Шуберт М., Маккеленберг М.Т., Маасс Н. и Алкатаут И., Европейский журнал акушерства, гинекологии и репродуктивной биологии, 2015, 194, 38–42. [PubMed] [Google Scholar] 37. Масмали А.М., Пурслоу С. и Мерфи П.Дж., Клиническая и экспериментальная оптометрия, 2014 г., 97, 399–406.[PubMed] [Google Scholar] 38. Равиндер Р., Кайпа О., Баддела В.С., Сингхал Синха Э., Сингх П., Наян В., Велагала С.С., Байталу Р.К., Онтеру С.К. и Сингх Д., Териогенология, 2016, 86, 1147–1155. [PubMed] [Google Scholar] 39. Пардо-Кармона Б., Мояно М.Р., Фернандес-Паласиос Р. и Перес-Марин К.С., Журнал практики обращения с мелкими животными, 2010 г., 51, 437–442. [PubMed] [Google Scholar]41. Løvendahl P и Chagunda MGG, Journal of Dairy Science, 2010, 93, 249–259. [PubMed] [Google Scholar]42. Гнот С., Годехардт Д., Годехардт Э., Франк-Херрманн П. и Фрейндл Г., Репродукция человека, 2003, 18, 1959–1966.[PubMed] [Google Scholar]

Недорогое устройство на базе смартфона для тестирования овуляции по месту оказания медицинской помощи

Лабораторный чип. Авторская рукопись; Доступно в PMC 2019 18.

Опубликовано в окончательной редактированной форме AS:

PMCID: PMC6321627

NIHMSID: NIHMS1001781

, ^{# 1} , ^{# 1} , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ² и ^{1, 3, *} 8 Vaishnavi Potluri

¹ Инженерное отделение в медицине, Медицинский факультет, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Хемант Кандула

¹ Инженерно-техническое отделение медицины, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бост on, MA, USA

Prudhvi Thirumalaraju

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Manoj Kumar Kanakasabapathy

1^{4 Инженерное дело в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Сандип Кота Сай Паван

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардский медицинский университет Школа, Бостон, Массачусетс, США

Дивьянк Ярраварапу

¹ Инженерно-техническое отделение Медицинского факультета, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Ананд Сундарараджан

^{5 Отделение 1 инженерии в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Ka Ртик Баскар

¹ Инженерное отделение медицины, Медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Neeraj Gudipati

¹ Инженерное отделение медицины, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

John С.

Petrozza

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Больница общего профиля Массачусетса, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США , Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Медицинский факультет, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

¹ Инженерное отделение в медицине, Женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Массачусетская больница общего профиля, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Отделение Медицина, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

^# Внесли равный вклад.

Авторские взносы

H.S. и М.К.К. спроектировал исследование. П.В. и П.С.К. провел эксперименты и оптимизировал показания теста. М.К.К консультировал и помогал в экспериментальном процессе. Дж.Ч.П., А.С. и К.Б. помогали собирать образцы у испытуемых и проводить эксперименты. Д.Ю., П.Т., Х.К. и С.К.С.П. спроектировал устройство и выполнил его изготовление, а также оказал помощь в исследованиях по оптимизации устройства. П.В. и П.С.К. разработал микрожидкостное устройство для работы с образцами.Х.К. и Р.Г. разработали код смартфона для обнаружения структуры папоротника и разработали графический пользовательский интерфейс приложения для смартфона. Н.Г. помог в разработке кода смартфона. П.В. и П.С.К. проанализировали данные, а М.К.К. дал рекомендации по анализу данных. J.C.P. обеспечена клиническая поддержка и материально-техническое обеспечение. П.В., П.С.К., М.К.К. и Х.С. написал рукопись. Все авторы отредактировали рукопись. Окончательная отредактированная версия этой статьи доступна в Lab Chip См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Возможность точного прогнозирования овуляции в домашних условиях с помощью недорогой диагностики в месте оказания медицинской помощи может оказаться существенной помощью для пар, предпочитающих естественное планирование семьи. Обнаружение гормонов, специфичных для овуляции, в образцах мочи и мониторинг базальной температуры тела в настоящее время являются общепринятыми домашними методами, используемыми для обнаружения овуляции; однако эти методы относительно дороги для длительного использования, а результаты трудно понять. Здесь мы сообщаем об устройстве на базе смартфона для автоматизированного тестирования овуляции с использованием искусственного интеллекта (ИИ) путем обнаружения узоров папоротника в небольшом объеме (<100 мкл) слюны, высушенной воздухом на микрофлюидном устройстве.Мы оценили работу устройства с использованием образцов искусственной слюны и слюны человека и обнаружили, что устройство показало точность >99% в эффективном прогнозировании овуляции.

Graphical Abstract

Недорогой, быстрый, автоматизированный микрочип на базе смартфона для тестирования овуляции путем обнаружения структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны с использованием искусственного интеллекта.

Введение

Планирование семьи укрепляет права людей определять количество детей и интервалы между их рождением.Время полового акта по отношению к овуляции сильно влияет на вероятность успешного зачатия и может быть эффективным методом естественного планирования семьи ¹ . Почти 44% всех беременностей во всем мире являются незапланированными или непреднамеренными ^{2, 3} . Непреднамеренная беременность может иметь неблагоприятные последствия для здоровья как матери, так и ребенка и сопряжена со значительным экономическим и социальным бременем. Кроме того, только в 2010 году расходы на роды, аборты и выкидыши в результате незапланированной беременности составили более 21 миллиарда долларов государственных средств в США ^{4, 5} .Исследование также показало, что услуги по планированию семьи сами по себе помогли снизить число нежелательных беременностей и связанные с этим расходы почти на 70% ^{5, 6} . Простой недорогой инструмент, который может помочь в планировании семьи, поможет женщинам избежать нежелательной беременности и будет иметь большое значение для тех пациенток, которые пытаются зачать ребенка.

Естественное планирование семьи использует физические признаки, симптомы и физиологические изменения для прогнозирования фертильности женщины ^{7, 8} . Некоторые из методов мониторинга женской фертильности включают обнаружение овуляции посредством определения уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ), оценку активности бета-глюкуронидазы в слюне, ректальный или оральный анализ базальной температуры тела, характеристику цервикальной слизи и анализ слюнного папоротника ⁹ .Анализ слюнных папоротников относительно недорог и прост, что делает его привлекательной альтернативой большинству доступных подходов ¹⁰ . Во время фолликулярной фазы менструального цикла с повышением уровня эстрадиола в крови происходит увеличение электролитов слюны, что приводит к стойкому папоротниковому виду, кристаллизованной структуре, напоминающей листья папоротника, в высушенной на воздухе слюне и может быть использовано для определить период овуляции ^{10, 11} . Структуры папоротника наблюдались у овулирующих женщин в течение 4-дневного окна около дня овуляции ¹² .Тем не менее, современные тесты на овуляцию, основанные на слюнном папоротнике, являются ручными и очень субъективными, что вызывает неправильную интерпретацию, когда их выполняет непрофессиональный потребитель ¹³ .

Искусственный интеллект (ИИ) получает признание в медицине, и одним из основных его применений в здравоохранении является его способность точно интерпретировать сложные медицинские данные со сверхчеловеческой точностью и последовательностью ¹⁴ . Уже было показано, что ИИ исключительно хорошо работает в таких приложениях, как прогнозирование риска сердечно-сосудистых заболеваний ¹⁵ , скрининг рака кожи ¹⁶ и обнаружение диабетической ретинопатии ¹⁷ .Достижения в области микроэлектроники и машинного обучения позволили современным методам, основанным на искусственном интеллекте, одинаково хорошо работать на портативных системах, особенно на смартфонах. Смартфонами пользуются более 4,4 миллиарда человек по всему миру, что делает их отличным кандидатом на разработку технологий для оказания медицинской помощи ¹⁸ . Фактически, камеры смартфонов использовались в тестах по месту оказания медицинской помощи как для качественного, так и для количественного определения клинически значимых биомаркеров для выявления заболеваний или мониторинга лечения, таких как выявление ВИЧ/СПИДа и сифилиса ^19–21 , герпеса ²² , серповидноклеточная анемия ²³ , мужское бесплодие ^24–29 и Зика ^{30, 31} .

Здесь мы сообщаем о простом, недорогом и автоматизированном устройстве на базе смартфона для тестирования овуляции по месту оказания медицинской помощи, которое использует искусственный интеллект для точного обнаружения паттернов папоротника в небольшом объеме (~ 100 мкл) воздушно-сухой слюны. образцы помещают на микрожидкостное устройство (). Мы использовали нейронную сеть для быстрого (менее 31 секунды) анализа и обнаружения папоротников в высушенных на воздухе образцах слюны. Нейронная сеть использует архитектуру MobileNet, предварительно обученную на 1,4 миллионах изображений ImageNet и повторно обученную на изображениях слюнных папоротников.Устройство на базе смартфона смогло определить овуляцию с точностью 99,5% при тестировании 200 изображений человеческой слюны, собранных во время овуляционных и неовуляционных фаз менструального цикла у 6 женщин.

Этапы проведения теста слюнного папоротника на основе смартфона.

(A) Слюну собирают на микрожидкостном устройстве, смазывают тампоном и оставляют для сушки на воздухе. (B) Оптическая система подключена к совместимому смартфону для тестирования.(C) Микрожидкостное устройство с высушенным на воздухе образцом вставляется в оптическую насадку, и тест инициализируется с помощью разработанного пользовательского приложения для Android. (D) Программное обеспечение анализирует образец папоротника, демонстрируемый высушенными на воздухе образцами слюны, и определяет, находится ли субъект в овуляционной или неовуляционной фазе менструального цикла.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Целью данного исследования была разработка автоматизированного устройства для определения овуляции у женщин с помощью теста слюнного папоротника.В исследовании приняли участие 6 здоровых женщин в возрасте от 20 до 22 лет. Субъекты были отобраны на основе следующих критериев: 1) у них в анамнезе были нормальные менструальные циклы; 2) Они не употребляли табак и алкоголь и 3) Они не использовали гормональную контрацепцию в течение периода исследования. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Набранные субъекты предоставили информированное согласие до сбора образцов слюны.Каждому испытуемому давали микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл для сбора образца рано утром перед чисткой зубов. Образцы слюны собирали во время овуляционных и неовуляционных фаз. Две различные фазы были идентифицированы с использованием теста мочи Clear Blue ^® (ЛГ + эстроген) в качестве эталона. Образцы загружали в микрожидкостное устройство и анализировали с помощью оптической системы на базе смартфона. Также был проведен ручной анализ на наличие слюнного папоротника с использованием микроскопа на этапе обучения сети.

Оптическая насадка

Для проведения этого исследования мы разработали оптическую насадку для смартфона (83 × 97 × 74 мм), которая была напечатана на 3D-принтере с помощью Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и полимолочной кислоты (PLA) (Ultimaker). печатный материал (). Оптическая схема прибора содержала плосковыпуклую линзу диаметром 9 мм с фокусным расстоянием 13,5 мм для увеличения и стандартную акриловую линзу диаметром 12 мм с фокусным расстоянием 30 мм в качестве конденсора. Объективы были совмещены с оптической осью фронтальной камеры смартфона.Насадка была разработана в SolidWorks (Dassault Systèmes) для смартфона Moto X (Motorola, XT1575). Движение микрофлюидного устройства по оси X (параллельно установке линзы) было достигнуто с помощью редукторного двигателя постоянного тока 6 В, 100 об / мин (B07556CZL1, Walfront) с ходовым винтом M3, прикрепленным к валу. Устройство питалось от щелочной батареи 9 В (B000099SKB, Energizer). Для освещения микрофлюидного чипа использовали рассеянный белый светоизлучающий диод (LED) 5 В (IL153, ​​Microtivity). Одноплатный микроконтроллер (NodeMCU) использовался для управления движением микрожидкостного устройства.Принципиальная схема установки приведена в дополнительной информации (рис. S1).

Схематическое изображение оптической системы на базе смартфона и одноразового микрожидкостного устройства.

(A) Покомпонентное изображение автономной оптической системы и ее различных компонентов. Система управляется по беспроводной связи с помощью смартфона для отображения структур папоротника на микрофлюидном устройстве. (B) Фактическое изображение изготовленной автономной оптической системы со смартфоном для визуализации и анализа структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны.(C) Взрыв микрофлюидного устройства с блоком мазка. (D) Фактическое микрожидкостное устройство, помещенное рядом с монетой в четверть доллара США.

Изготовление микрожидкостных устройств

Микрожидкостное устройство состояло из поли(метилметакрилата) (ПММА) (8560K239, McMaster Carr), двустороннего клея (DSA), полимолочной кислоты (PLA) и предметного стекла (VWR, 48300–025). Corning 75×25 мм). Прозрачные листы PMMA и DSA вырезали с помощью лазерного резака (VLS 2.3, Universal Laser Systems Inc.). Лазерный резак также использовался для контролируемого травления ПММА для создания канавок. Канавки были протравлены на ПММА таким образом, чтобы внутренняя сторона полностью построенного микрофлюидного чипа служила направляющими для блока мазка. Небольшой участок (25 × 12 мм ² ) был оставлен открытым на одном конце предметного стекла для работы с микрожидкостным устройством (). Одна сторона DSA была приклеена к протравленной стороне канавки ПММА, а другая сторона была приклеена к предметному стеклу, которое использовалось в качестве нижней подложки для микрочипа.Мазковый блок (12 × 8 × 9,6 мм) был напечатан с использованием 3D-принтера Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и PLA в качестве материала для печати. Блок мазка использовался для смазывания образца внутри канала (40 × 5 мм ² ) микрожидкостного устройства для получения контролируемой тонкой пленки слюны. Микрожидкостное устройство также имело небольшой резервуар для загрузки образца на чипе.

Приложение для Android

Приложение для Android было разработано для сбора данных изображений с помощью оптической насадки смартфона и анализа узоров папоротника, присутствующих в высушенной воздухом слюне, для прогнозирования статуса овуляции.Когда микрофлюидное устройство с загруженным образцом было вставлено в оптическую насадку, микрофлюидное устройство перемещалось параллельно установке линзы для автоматического изображения всего канала слюнного папоротника. Приложение для Android управляло двигателями через NodeMCU и, следовательно, движением микрофлюидного устройства. Беспроводная связь между смартфоном и оптической системой была достигнута за счет настройки NodeMCU в качестве веб-сервера HTTP. Приложение захватывает видеокадры микроканала со скоростью ~ 5 кадров в секунду (fps).

Видеокадры были отобраны с 4-кратным увеличением, и каждый кадр был передан в обученную сеть для обнаружения присутствия папоротника. Время вывода для получения результата для каждого кадра составило ~200 мс для смартфона Moto X и может различаться для разных смартфонов. Пользовательский интерфейс приложения для смартфона был разработан, чтобы быть простым и удобным в использовании. Кроме того, результаты сохранялись в календарном событии для отслеживания цикла овуляции. Приложение для Android автоматически захватывает видеокадры, локально анализирует изображения и сообщает результат менее чем за 31 с.Для анализа не требуется доступ в интернет.

Сбор данных

Добровольных участников попросили собрать образцы слюны рано утром перед чисткой зубов, чтобы исключить любые расхождения в концентрации электролитов в слюне из-за повседневной деятельности человека. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Мы собирали образцы каждый день у каждой участницы в течение одного полного менструального цикла и тестировали их с помощью наших микрожидкостных устройств как во время овуляционной, так и неовуляционной фаз.Мы также использовали искусственную слюну для имитации узоров папоротника для обучения и тестирования алгоритма ИИ. Мы смоделировали 30 неовулирующих образцов в диапазоне от 0,1% до 1,4% и 34 овулирующих образца в диапазоне от 5,6% до 100% запаса искусственной слюны. Образцы были подготовлены, чтобы охватить широкий спектр папоротниковых и непапоротниковых структур. Подготовленные образцы загружали в микрожидкостные устройства и размазывали по узкому каналу с помощью размазывающего блока. Образцы высушенной на воздухе слюны затем визуализировались с помощью оптической системы на базе смартфона.Всего было получено 1640 изображений из образцов слюны человека и искусственной слюны, которые были классифицированы на 476 изображений с овуляцией и 1164 изображения без овуляции на основе паттернов папоротника. Аннотации для образцов с папоротником и без папоротника были получены путем ручного осмотра смоделированных образцов под настольным микроскопом. Статус овуляции для образцов человеческой слюны был установлен с помощью анализа мочи (ЛГ + эстроген) в дополнение к ручной проверке.

Обучение MobileNet

Чтобы классифицировать структуры папоротника на смартфоне, MobileNet предварительно обучен 1.В качестве архитектуры нашей нейронной сети ³² использовалось 4 миллиона изображений ImageNet с параметром множителя ширины α=0,50 и размером изображения 224×224 пикселя. ImageNet, набор данных с открытым исходным кодом, который содержит изображения без слюны из различных категорий, помог в предварительном обучении сети. Для сложной архитектуры нейронной сети, такой как MobileNet, набора данных примерно из 1500 изображений недостаточно для оптимизации их весов во время обучения. Поэтому мы использовали разнообразный крупномасштабный набор данных, чтобы «предварительно обучить» сеть, а затем уточнить ее, чтобы она работала для нашего приложения для анализа слюнных папоротников. Используемая модель MobileNet работала с точностью 1 первого уровня 64,0% и точностью 5 топового уровня 85,4 % по 1000 классам базы данных ImageNet.

MobileNet был специально разработан для эффективного использования ограниченных ресурсов, доступных на встроенных устройствах, таких как смартфоны. Сеть использует свертки с разделением по глубине для построения облегченных глубоких нейронных сетей, в отличие от традиционных нейронных сетей свертки, которые используют стандартную двумерную свертку. Стандартная двумерная свертка применяет ядро ​​свертки ко всем каналам входного изображения.2D-свертка перемещает ядра по всем каналам входного изображения и вычисляет взвешенную сумму входных пикселей, применяемых ядром для всех входных каналов. Глубинная свертка — это пространственная разделимая свертка, выполняемая на отдельных каналах, выходные данные которой вычисляются в новый канал с помощью точечной свертки (стандартная свертка с ядром 1×1).

Структуры MobileNet были построены с помощью разделимых по глубине сверток, за исключением первого слоя, который был построен со стандартной сверткой 3×3. За каждым сверточным слоем следует выпрямленная линейная единица (ReLU) и нормализация партии. Последний уровень MobileNet содержит средний объединяющий слой для уменьшения пространственного разрешения до 1, за которым следует полносвязный слой, который был передан на наш уровень классификации для обнаружения. Выборка вниз выполнялась с помощью шаговой свертки в свертках по глубине, а также в первом слое. Вместо обучения модели с нуля была использована техника трансферного обучения. Мы использовали предварительно обученные веса MobileNet, который был обучен на ImageNet для повторного использования его возможностей извлечения признаков.Слой классификации был добавлен в конце и был обучен классифицировать образцы слюны на овулирующие и неовулирующие на основе шаблонов папоротника. Только классификационный слой был обучен, а остальные слои остались нетронутыми. Выходные данные полностью подключенного слоя оставались одинаковыми для каждого изображения, и выходные данные использовались несколько раз. Поскольку расчет результатов занимал значительное время, мы создали узкие места на выходе, чтобы сократить время обучения. Выходные данные полносвязного слоя использовались в качестве входных данных для слоя классификации.Истинные метки передавались в сеть как наземные, и вычислялись точность, перекрестная энтропия и градиенты ().

Графическое изображение потока данных с обучающими и проверочными кривыми для точности и перекрестной энтропии.

(A) Вычислительный поток данных. (B) Набор данных папоротниковых и непапоротниковых изображений был обучен и проверен на более чем 4000 тренировочных шагов со скоростью обучения 0,01. К 4000-му шагу обучения точность проверки и потеря перекрестной энтропии достигли предела.

Эффективность обучения измерялась перекрестной энтропией, которая использовалась в качестве функции потерь, чтобы узнать, насколько хорошо сеть обучается. Точность обучения — это процент правильно помеченных изображений в обучающем пакете, а точность проверки — это процент правильно помеченных изображений, отличных от изображений в обучающем пакете. Разница между двумя точностями использовалась для определения того, является ли модель переоснащением.

Для трансферного обучения мы повторно обучили MobileNet, предварительно обученную на ImageNet, для 4000 обучающих шагов (эпох) со скоростью обучения, установленной на 0.01 с использованием наших наборов данных слюны. Вес модели, достигший наименьшей потери перекрестной энтропии, сохранялся и использовался. На 1000 ^-м шаге обучения потеря перекрестной энтропии при проверке составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45% (). В рамках процесса обучения размеры всех изображений, используемых во время обучения, были изменены до 224×224 пикселей с использованием библиотек компьютерного зрения (OpenCV) и обучены в среде TensorFlow. Обученная таким образом нейронная сеть выполняла всю обработку и анализ локально, без необходимости доступа к Интернету.

Методы визуализации данных

Карты значимости были созданы с использованием TensorFlow. SmoothGrad, примененный к выходным данным, полученным из полносвязного слоя свертки, использовался для повышения резкости карт чувствительности на основе градиента ^{33, 34} . Мы сопоставили активации слоя активации сразу после полносвязного слоя свертки. При создании карт заметности использовались изображения как искусственной слюны, так и изображений тестового набора слюны человека. Встраивание стохастических соседей по t-распределению (t-SNE) было выполнено для наблюдения за распределением набора тестовых данных в 2D-пространстве и для проверки того, способна ли наша модель точно различать овулирующие и неовулирующие образцы.

Искусственная слюна

Искусственная слюна использовалась для имитации папоротников. Состав искусственной слюны следующий: 0,92 г/л ксантановой камеди (Q8185, MP Biomedicals), 1,2 г/л хлорида калия (L1117, Chemcruz), 0,85 г/л хлорида натрия (031M0215V, Sigma), 0,05 г. л хлорида магния (030M0060V, Sigma), 0,13 г/л хлорида кальция (057K0005, Sigma), 0,13 г/л дикалия гидроортофосфата (SLBS6839, Sigma) и 0,35 г/л метил-п-гидроксибензоата (Q7915, MP биомедицинские препараты).рН искусственно приготовленной слюны составлял 7,0. pH нормальных образцов слюны колеблется от 6,2 до 7,6. Мы подготовили исходный раствор и разбавили его деионизированной водой, чтобы имитировать образцы слюны, полученные от овулирующих и неовулирующих людей. Ниже приводится разбивка концентраций искусственной слюны, показывающая три фазы папоротника: непапоротниковый — от 0,1% до 1,4%, переходный — от 1,5% до 5,6% и папоротниковый — от 5,6% до 100% приготовленного запаса искусственной слюны.

Результаты

Характеристика оборудования для анализа овуляции на основе смартфона

Система тестирования овуляции на основе смартфона была разработана таким образом, чтобы быть простой и с минимальным вмешательством пользователя (, ).Аппаратные компоненты системы состояли из оптической насадки для смартфона для увеличения изображения образца и микрожидкостного устройства для работы с образцом слюны (, ). Оптическая насадка для смартфона, напечатанная на 3D-принтере, была легкой (208 г) и компактной (83 × 70 × 74 мм). Он использовал переднюю камеру смартфона для изображения и был прикреплен к телефону с помощью простого надвижного механизма. Увеличение изображения, достигнутое системой смартфона, составило 4×, что было сравнимо с цифровыми изображениями, полученными с помощью стандартного лабораторного микроскопа (Carl Zeiss AG Axio Observer D1) при 10-кратном увеличении.Эффективное поле зрения системы составляло 2,19 × 2,95 мм. Отображая микрометровый масштаб с помощью оптической системы, мы заметили, что 1 мкм на записанном изображении представлен 0,226 пикселями (рис. S2A), однако разрешение оптической системы сотового телефона составляло 7 мкм, что было установлено при отображении изображения 1951 года. Целевое разрешение ВВС США (USAF) (рис. S2B). Система была моторизована вдоль одной оси и фокальной плоскости для автоматизации визуализации микрожидкостного канала. Микрожидкостное устройство, содержащее образец слюны, было оптимально сфокусировано путем размещения устройства на рабочем расстоянии от установки линзы, что помогло исключить ручную фокусировку пользователем.Общая стоимость материала для изготовления аксессуара для смартфона и микрофлюидного устройства составила 13,91 доллара США, включая 13,58 доллара США на оптическую насадку и 0,33 доллара США на микрофлюидное устройство (таблица S1). Приложение для смартфона было разработано, чтобы направлять пользователя на каждом этапе тестирования (рис. S3). Разработанная система записывала видео со скоростью ~ 5 кадров в секунду, покрывая площадь 2,1 × 22,6 мм ² микрофлюидного устройства за <31 секунду на образец, в течение которых приложение для смартфона отображало, локально анализировало и сообщало результат.

Микрожидкостное устройство для работы с образцами

Микрофлюидное устройство было разработано с резервуаром для загрузки образца слюны и узким микроканалом для визуализации воздушно-сухого образца. Образец слюны наносится на зону визуализации устройства с помощью простого накладного блока, напечатанного на 3D-принтере ()

. Среднее время высыхания образца слюны на микрожидкостном устройстве составило 6,7 ± 1,5 минуты по сравнению с минимальными 25 минутами. на обычном предметном стекле (n=8, по 3 повторности) (рис.С4). Был проведен регрессионный анализ методом наименьших квадратов, и наклоны линий для микрожидкостных устройств и групп предметных стекол составили 0,008 (95% доверительный интервал: от -0,003 до 0,02) и 0,52 (95% доверительный интервал: 0,29 до 0,74) со значениями R ² 0,30 и 0,97 соответственно (рис. S4). При размазывании образца создается тонкая пленка на стеклянной подложке микрофлюидного устройства, что минимизирует время высыхания образца независимо от его объема.

Работа системы в искусственной слюне

Образцы искусственной слюны использовались для обучения нейронной сети.Используя 492 аннотированных изображения, состоящих из 168 изображений с узорами папоротника и 324 изображений без узоров папоротника, мы переобучили и проверили нашу модель для классификации изображений на две категории образцов с овуляцией и без овуляции. Способность переобученной модели MobileNet предсказывать правильный результат оценивалась с использованием 100 изображений с паттернами папоротника и 100 изображений без паттернов папоротника смоделированной искусственной слюны. Эффективность сети при оценке высушенных на воздухе образцов слюны составила 90% с 95% доверительными интервалами (ДИ), которые варьировались от 84.от 98% до 93,78% (, S5A). Сеть работала с чувствительностью 97,62% (ДИ: от 91,66% до 99,71%) и специфичностью 84,48% (ДИ: 76,59% до 90,54%) (, S5A) при оценке образцов папоротника искусственных образцов слюны. Для данного набора тестов положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) системы составляли 82% (ДИ: от 74,85% до 87,46%) и 98% (ДИ: 92,56% до 99,48%) соответственно ( , С5А). График t-SNE был создан для визуализации степени разделимости данных в двумерном пространстве ().Между двумя образцами наблюдалась хорошая степень разделения.

Производительность системы с образцами искусственной и человеческой слюны вместе с визуализацией TSNE.

(A) Точечный график иллюстрирует эффективность системы при оценке высушенных на воздухе образцов искусственной слюны (n = 200). (B) График иллюстрирует производительность системы при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека (n = 200). Квадраты представляют собой истинные метки, а кружки внутри них представляют собой классификацию системы.Синие квадраты и кружки представляют образцы слюны без овуляции, а красные квадраты и кружки представляют образцы слюны с овуляцией. (C) Диаграмма рассеивания помогает визуализировать разделение овулирующих и неовулирующих образцов на основе структур папоротника, представленных высушенными на воздухе образцами искусственной и человеческой слюны. Карта заметности была извлечена из сети, чтобы выделить наиболее взвешенные функции изображения. Черный цвет обозначает функции с наименьшим весом, а белый цвет указывает на функции с наибольшим весом на изображении.

Работа системы с человеческой слюной

Мы также оценили способность системы различать овулирующие и неовулирующие образцы человеческой слюны. Женщины (n = 6) собирали и тестировали образцы своей слюны с помощью системы мобильного телефона во время овуляционной и неовуляционной фаз менструального цикла, и результаты были подтверждены с помощью анализа мочи Clear Blue ^® (LH + эстроген). Испытуемых просили плюнуть на резервуар микрофлюидного устройства и намазать его на микроканал для просушки воздухом.Используя дополнительные 748 аннотированных изображений образцов слюны человека, состоящих из 108 изображений с овуляцией и 640 изображений без овуляции, полученных от субъектов (n = 6), мы переобучили и проверили разработанную нейронную сеть. Вся сеть была обучена 4000 тренировочным шагам со скоростью обучения 0,01, при использовании которой были достигнуты самые низкие проверочные веса. На 1000 ^-м шаге обучения перекрестная энтропия проверки составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45%. На 4000 ^-м -м шаге обучения мы заметили, что точность осталась неизменной без снижения перекрестной энтропийной потери.Между кривыми точности обучения и проверки была небольшая предельная разница, указывающая на то, что модель не была переоснащена (). Способность переобученной модели MobileNets предсказывать правильный результат оценивалась с использованием набора из 100 изображений с узорами папоротника и 100 изображений без узоров папоротника. Точность нейронной сети в прогнозировании образца слюны как овулирующей и неовулирующей составила 99,5% с ДИ в диапазоне от 97,25% до 99,99% (, S5B). Чувствительность и специфичность системы смартфонов с искусственным интеллектом при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека составила 99.01% (ДИ: от 94,61% до 99,97%) и 100% (ДИ: 96,34% до 100%) соответственно (, S5B). Мы выполнили t-SNE, чтобы визуализировать разделение набора данных сетью в 2D-пространстве (). Увидев отличное разделение между двумя классами, мы дополнительно исследовали сеть, сопоставив последние слои активации, чтобы визуализировать значимость. С помощью карт заметности ³⁴ мы смогли определить пиксели, которые используются сетью, и подтвердили, что она сосредоточилась на функциях, относящихся к шаблону папоротника в процессе принятия решений ().PPV и NPV системы для данного тестового набора составили 100% и 99,0% (ДИ: от 93,37% до 99,86%) соответственно.

Адаптируемость системы к различным смартфонам

Чтобы оценить возможность обобщения разработанного алгоритма искусственного интеллекта на устройства и системы визуализации, мы протестировали высушенные на воздухе образцы искусственной слюны с различными концентрациями аналитов, представляющих фазы овуляции и неовуляции, с использованием 5 разных смартфонов. В этом исследовании мы использовали Samsung Galaxy 5, Xiaomi Redmi Note 4, OnePlus 5T, LG G6 и Moto X.Использовался базовый алгоритм, обученный как на изображениях воздушно-сухих образцов искусственной слюны, так и на образцах слюны человека, полученных с помощью устройства Moto X, и никакого дополнительного обучения для адаптации сети к тестируемым устройствам не проводилось. Сеть работала с отличной согласованностью на всех протестированных устройствах, получив отличную оценку 1,0 (нижний 95% ДИ: 1,0) в альфа-тесте Кронбаха на согласованность (n = 15 с 5 телефонами) (таблица S2). Эти результаты показывают, что разработанная сеть хорошо обобщается для различных смартфонов, протестированных в этом исследовании.

Обсуждение

Точное определение овуляции полезно при планировании семьи. Текущий домашний тест мочи выявляет внезапный всплеск ЛГ, что помогает определить фазу овуляции. Хотя ЛГ в моче легко проверить, люди из менее развитых стран не имеют доступа к этим относительно дорогим наборам для тестирования. Кроме того, тест на папоротник может быть более надежным у пациенток с ложноположительными реакциями на набор для определения ЛГ в моче, например у женщин с синдромом поликистозных яичников и повышенным уровнем ЛГ.В настоящее время тесты слюнного папоротника проводятся с использованием капли подъязычного образца слюны, помещенной на предметное стекло, которую затем сушат и вручную тестируют на папоротниковые структуры ³⁵ . Ручное тестирование очень субъективно и может привести к неправильной интерпретации результатов неспециалистами.

Мы разработали автоматизированную оптическую систему на базе смартфона, которая может точно определять овуляцию у женщин, используя небольшой объем (<100 мкл) высушенных на воздухе образцов слюны, загруженных в микрофлюидное устройство, посредством обнаружения папоротника слюны с помощью анализа на основе искусственного интеллекта по телефону. .Наше микрожидкостное устройство обеспечивает быстрое (<7 минут) высыхание образца слюны за счет создания тонких пленок и обеспечивает контролируемый объем образца для анализа. Традиционные методы точечного размещения не контролируют объем образца и, таким образом, часто имеют тенденцию вызывать ложный сигнал.

Хотя контроль объема образца слюны достигается в микрожидкостном устройстве, мы заметили, что узоры папоротника не одинаково распространены по всему микроканалу, а обнаруживаются в виде пакетов. Вероятно, это связано с перераспределением растворенного вещества в микрофлюидном устройстве во время формирования тонких пленок в сочетании с неравномерным испарением. В таком случае для точного предсказания узоров папоротника мы визуализировали весь микроканал, чтобы убедиться, что все узоры папоротника на микрофлюидном устройстве были захвачены и проанализированы. Точность системы при классификации образцов слюны и обнаружении структур папоротника в неразбавленных, необработанных образцах слюны составила 99,5% (). Оптический фокус и равномерная интенсивность света были зафиксированы в оптической системе, чтобы избежать ошибок ручной настройки.

Разработанная система визуализации может быть использована для других приложений, которые включают визуализацию микроструктур в освещенной среде, например, для обнаружения структур папоротника в амниотической жидкости для диагностики преждевременного разрыва плодных оболочек (PROM) у беременных женщин ³⁶ и слезной пленки для обнаружения болезнь сухого глаза ³⁷ .Разрыв плодных оболочек (ПЗУ) – разрыв амниотического мешка, происходящий до начала родов ³⁶ . С другой стороны, болезнь сухого глаза диагностируется путем проверки глазной слезной пленки на наличие узоров папоротника. Образцы здоровой слезы образуют плотные узоры папоротника, которые отсутствуют в образцах сухого глаза ³⁷ .

Экспресс-тест на овуляцию по месту оказания медицинской помощи также имеет важное применение в животноводстве. Разведение животных в основном зависит от цикла размножения вида и ограничено во времени.Одним из важных критериев разведения животных является определение оптимального времени разведения животного для достижения более высокой степени оплодотворяемости. Для яйцеклетки, оплодотворенной в более позднем возрасте, шансы на аборт выше. Поэтому существует необходимость в расширенном прогнозировании овуляции. Разработанная автоматизированная оптическая система на основе смартфона потенциально может быть использована для анализа моделей выделения слюны у животных, таких как буйволы ³⁸ , собаки ³⁹ и других млекопитающих, для прогнозирования и подтверждения их овуляции и определения оптимального времени осеменения.Чтобы определить время осеменения, многие заводчики животных полагаются на ручные методы, такие как индикация охоты, но это не всегда точно; овуляция может происходить до, во время или после видимой течки ⁴⁰ . Другие устройства, такие как электронные шагомеры или метки активности, используются для обнаружения овуляции путем отслеживания изменений в поведении, таких как беспокойство, стоячая течка, поведение вскакивания и повышенная физическая активность животных ⁴¹ . Некоторые животные чувствительны к этим типам измерений, и животноводам становится трудно проверять их с помощью этих методов.Чтобы исключить такие осложнения, необходима регулярная, доступная и удобная система определения овуляции для эффективного управления разведением животных.

Одним из основных преимуществ указанного подхода по сравнению со всеми другими доступными методами является его экономическая эффективность в долгосрочной перспективе ¹⁰ . Общая стоимость материала для нашего подхода составляет ~ 14 долларов США, и его можно полностью использовать повторно. Тесты на основе мочи могут стоить от 1 до 2 долларов за тест, однако они не подлежат повторному использованию, и, таким образом, за цикл общий тест может стоить примерно 35-40 долларов для пользователя в США. Согласно предыдущим отчетам, большинство женщин беременеют в течение 6 циклов, поэтому, по нашим оценкам, эти одноразовые тесты могут в совокупности стоить более 200 долларов США для большинства женщин ⁴² . Следует отметить, что прямое сравнение затрат, связанных с анализами мочи и тестированием слюны на основе ИИ, ограничено, поскольку заявленные нами материальные затраты не включают затраты, связанные с коммерциализацией продукта и каналами сбыта. Кроме того, поскольку он выполняет весь необходимый анализ на телефоне без необходимости в Интернете, он особенно привлекателен для использования в условиях ограниченных ресурсов.

Одним из ограничений разработанной оптической системы на базе смартфона является обнаружение овуляции у женщин с дисбалансом эстрогенов, кистами в яичниках и у тех, кто принимает лекарства от бесплодия. Кроме того, после курения или употребления алкоголя следует обеспечить достаточный промежуток времени перед тестированием. Если на эти состояния не обращать должного внимания, они могут вызвать папоротникообразные структуры при отсутствии овуляции. Наша система может определить все фертильное окно, включая точный день овуляции, когда шансы на зачатие выше.Кроме того, включение базальной температуры тела может помочь в преодолении текущих ограничений системы и, таким образом, требует дальнейших исследований. Продемонстрированная здесь работа является примером того, как искусственный интеллект, интегрированный со смартфонами вместе с недорогим оборудованием, может быть преобразован в эффективный диагностический анализ по месту оказания медицинской помощи, который может удовлетворить потребность в домашнем управлении фертильностью и планировании семьи.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Снеху Сундар и Фенила Доши за продуктивные обсуждения.Эта работа частично поддерживается экспериментальным грантом Исследовательского института Бригама, Инновационным вечнозеленым фондом (Исследовательский институт Бригама, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа), 1R01AI118502 и P30ES000002, R21HD092828 (Национальный институт здравоохранения) и Гарвардским национальным институтом гигиены окружающей среды. Научный грант (Гарвардская школа общественного здравоохранения им. Т. Х. Чана, Гарвардский центр гигиены окружающей среды) и Премия Американского общества репродуктивной медицины (Американский совет акушерства и гинекологии, Американский колледж акушеров и гинекологов, Американское общество репродуктивной медицины и Общество Репродуктивная эндокринология и бесплодие).

Сноски

Конфликт интересов

У авторов нет конфликтов интересов, о которых следует заявить.

Ссылки

1. Wilcox AJ, Weinberg CR and Baird DD, New England Journal of Medicine, 1995, 1517–1521. [PubMed] [Google Scholar]4. Сонфилд А., Хастедт К. и Голд Р.Б. Движение вперед: планирование семьи в эпоху реформы здравоохранения, Институт Гуттмахера, Нью-Йорк, 2014 г. [Google Scholar]5. Сонфилд А. и Кост К., Государственные расходы в связи с незапланированной беременностью и роль программ государственного страхования в оплате медицинских услуг, связанных с беременностью: оценки по стране и штату за 2010 г. , Институт Гуттмахера, Нью-Йорк, 2015 г.[Google Академия]6. Frost JJ, Frohwirth LF and Zolna MR, Contraceptive Needs and Services, Update 2014, Guttmacher Institute, New York, 2016. [Google Scholar]7. Стэнфорд Дж. Б., Лемэр Дж. К. и Турман П. Б., Журнал семейной практики, 1998, 46, 65–71. [PubMed] [Google Scholar]8. Паллоне С.Р. и Бергус Г.Р., Журнал Американского совета семейной медицины: JABFM, 2009, 22, 147–157. [PubMed] [Google Scholar]9. Guida M, Tommaselli GA, Pellicano M, Palomba S и Nappi C, Гинекологическая эндокринология: официальный журнал Международного общества гинекологической эндокринологии, 1997, 11, 203–219.[PubMed] [Google Scholar] 11. Эрсиари Р.М., Вихарджа Р. и Дарджан М., Стоматологический журнал Паджаджаран, 2014, 26, 194–202. [Google Академия] 12. Salmassi A, Schmutzler AG, Püngel F, Schubert M, Alkatout I и Mettler L, Gynecologic and Obstetric Investigation, 2013, 76, 171–176. [PubMed] [Google Scholar] 13. Guida M, Tommaselli GA, Palomba S, Pellicano M, Moccia G, Di Carlo C и Nappi C, Fertility and стерильность, 1999, 72, 900–904. [PubMed] [Google Scholar] 15. Поплин Р., Варадараджан А.В., Блумер К., Лю Ю., МакКоннелл М.В., Коррадо Г.С., Пэн Л. и Вебстер Д.Р., Nature Biomedical Engineering, 2018, 2, 158–164.[Google Академия] 17. Гульшан В., Пэн Л., Корам М., Стамп М.С., Ву Д., Нараянасвами А., Венугопалан С., Виднер К., Мадамс Т., Куадрос Дж., Ким Р., Раман Р., Нельсон П.С., Мега Дж.Л. и Вебстер Д.Р., Джама, 2016, 316 , 2402–2410. [PubMed] [Google Scholar] 18. Jonsson P, Carson S, Sethi JS, Arvedson M, Svenningsson R, Lindberg P, Öhman K and Hedlund P, Ericsson Mobility Report, Ericsson, Стокгольм, Швеция, 2017 г. [Google Scholar]19. Канакасабапати М.К., Пандья Х.Дж., Драз М.С., Чуг М.К., Садасивам М., Кумар С., Этемад Б., Йогеш В., Сафави М., Асгар В., Ли Дж.З., Цибрис А.М., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., Лаборатория на чипе, 2017, 17 , 2910–2919.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]20. Лаксанасопин Т., Го Т.В., Наяк С., Шридхара А.А., Се С., Оловукере О.О., Кадину П., Мэн Ф., Чи Н.Х., Ким Дж., Чин К.Д., Муньязеса Э. , Мугванеза П., Рай А.Дж., Мугиша В., Кастро А.Р., Штайнмиллер Д. , Линдер В., Джастман Дж. Э., Нсанзимана С. и Сиа С. К., Science Translational Medicine, 2015, 7, 273re271. [PubMed] [Google Scholar] 21. Драз М.С., Кочебйоки К.М., Васан А., Батталапалли Д., Шрирам А., Канакасабапати М.К., Каллакури С., Цибрис А., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., Nature Communications, 2018, 9, 4282.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]22. Берг Б., Кортазар Б., Ценг Д., Озкан Х., Фенг С., Вэй К., Чан Р.И.-Л., Бурбано Дж., Фаруки К., Левински М., Ди Карло Д., Гарнер О.Б. и Озкан А., ACS Nano, 2015, 9, 7857 –7866. [PubMed] [Google Scholar] 24. Тирумалараджу П., Борман К.Л., Канакасабапати М., Доши Ф., Сутер И., Димитриадис И. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2018, 110, e432. [Google Академия] 25. Димитриадис И., Сюй Р., Канаксабапати М.К., Тирумалараджу П., Йогеш В., Танрикут С., Хсу Дж., Борман С.Л. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2018, 109, e24.[Google Академия] 26. Канакасабапати М., Тирумалараджу П. , Йогеш В., Натараджан В., Борман К.Л., Петроцца Дж.К. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017 г., 108, e74–e75. [Google Академия] 27. Kanakasabapathy MK, Sadasivam M, Singh A, Preston C, Thirumalaraju P, Venkataraman M, Bormann CL, Draz MS, Petrozza JC and Shafiee H, Science Translational Medicine, 2017, 9. [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Канакасабапати М., Тирумалараджу П., Йогеш В., Натараджан В., Борман К.Л., Бхоумик П., Вейга С., Петроцца Дж.С. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017, 108, e74.[Google Академия] 29. Борман К.Л., Канакасабапати М., Тирумалараджу П., Йогеш В., Натараджан В., Демик Дж., Бланшар А., Петроцца Дж.К. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017, 108, e74. [Google Академия] 30. Драз М.С., Лакшминараасимулу Н.К., Кришнакумар С., Батталапалли Д., Васан А., Канакасабапати М.К., Шрирам А., Каллакури С., Тирумалараджу П., Ли И., Хуа С., Ю К.Г., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., ACS Nano, 2018, 12, 5709 –5718. [Google Академия] 32. Ховард А.Г., Чжу М. , Чен Б., Калениченко Д., Ван В., Вейанд Т., Андреетто М. и Адам Х., ArXiv e-prints, 2017.[Google Академия] 33. Смилков Д., Торат Н., Ким Б., Виегас Ф., Ваттенберг М., Электронные отпечатки ArXiv, 2017. [Google Scholar]34. Симонян К., Ведальди А., Зиссерман А., ArXiv e-prints, 2013. [Google Scholar]35. Гюнтер В., Бауэр И., Хеддерих Дж., Меттлер Л., Шуберт М., Маккеленберг М.Т., Маасс Н. и Алкатаут И., Европейский журнал акушерства, гинекологии и репродуктивной биологии, 2015, 194, 38–42. [PubMed] [Google Scholar] 37. Масмали А.М., Пурслоу С. и Мерфи П.Дж., Клиническая и экспериментальная оптометрия, 2014 г., 97, 399–406.[PubMed] [Google Scholar] 38. Равиндер Р., Кайпа О., Баддела В.С., Сингхал Синха Э., Сингх П., Наян В., Велагала С.С., Байталу Р.К., Онтеру С.К. и Сингх Д., Териогенология, 2016, 86, 1147–1155. [PubMed] [Google Scholar] 39. Пардо-Кармона Б., Мояно М.Р., Фернандес-Паласиос Р. и Перес-Марин К.С., Журнал практики обращения с мелкими животными, 2010 г., 51, 437–442. [PubMed] [Google Scholar]41. Løvendahl P и Chagunda MGG, Journal of Dairy Science, 2010, 93, 249–259. [PubMed] [Google Scholar]42. Гнот С., Годехардт Д., Годехардт Э., Франк-Херрманн П. и Фрейндл Г., Репродукция человека, 2003, 18, 1959–1966.[PubMed] [Google Scholar]

Недорогое устройство на базе смартфона для тестирования овуляции по месту оказания медицинской помощи

Лабораторный чип. Авторская рукопись; Доступно в PMC 2019 18.

Опубликовано в окончательной редактированной форме AS:

PMCID: PMC6321627

NIHMSID: NIHMS1001781

, ^{# 1} , ^{# 1} , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ² и ^{1, 3, *} 8 Vaishnavi Potluri

¹ Инженерное отделение в медицине, Медицинский факультет, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Хемант Кандула

¹ Инженерно-техническое отделение медицины, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бост on, MA, USA

Prudhvi Thirumalaraju

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Manoj Kumar Kanakasabapathy

1^{4 Инженерное дело в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Сандип Кота Сай Паван

¹ Инженерное отделение в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардский медицинский университет Школа, Бостон, Массачусетс, США

Дивьянк Ярраварапу

¹ Инженерно-техническое отделение Медицинского факультета, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Ананд Сундарараджан

^{5 Отделение 1 инженерии в медицине, медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США}

Ka Ртик Баскар

¹ Инженерное отделение медицины, Медицинский факультет, Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Neeraj Gudipati

¹ Инженерное отделение медицины, медицинский факультет, Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

John С.

Petrozza

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Больница общего профиля Массачусетса, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США , Brigham and Women’s Hospital, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Медицинский факультет, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

¹ Инженерное отделение в медицине, Женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

² Отделение репродуктивной эндокринологии и бесплодия, отделение акушерства и гинекологии, Массачусетская больница общего профиля, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

³ Отделение Медицина, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

^# Внесли равный вклад.

Авторские взносы

H.S. и М.К.К. спроектировал исследование. П.В. и П.С.К. провел эксперименты и оптимизировал показания теста. М.К.К консультировал и помогал в экспериментальном процессе. Дж.Ч.П., А.С. и К.Б. помогали собирать образцы у испытуемых и проводить эксперименты. Д.Ю., П.Т., Х.К. и С.К.С.П. спроектировал устройство и выполнил его изготовление, а также оказал помощь в исследованиях по оптимизации устройства. П.В. и П.С.К. разработал микрожидкостное устройство для работы с образцами.Х.К. и Р.Г. разработали код смартфона для обнаружения структуры папоротника и разработали графический пользовательский интерфейс приложения для смартфона. Н.Г. помог в разработке кода смартфона. П.В. и П.С.К. проанализировали данные, а М.К.К. дал рекомендации по анализу данных. J.C.P. обеспечена клиническая поддержка и материально-техническое обеспечение. П.В., П.С.К., М.К.К. и Х.С. написал рукопись. Все авторы отредактировали рукопись. Окончательная отредактированная версия этой статьи доступна в Lab Chip См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Возможность точного прогнозирования овуляции в домашних условиях с помощью недорогой диагностики в месте оказания медицинской помощи может оказаться существенной помощью для пар, предпочитающих естественное планирование семьи. Обнаружение гормонов, специфичных для овуляции, в образцах мочи и мониторинг базальной температуры тела в настоящее время являются общепринятыми домашними методами, используемыми для обнаружения овуляции; однако эти методы относительно дороги для длительного использования, а результаты трудно понять. Здесь мы сообщаем об устройстве на базе смартфона для автоматизированного тестирования овуляции с использованием искусственного интеллекта (ИИ) путем обнаружения узоров папоротника в небольшом объеме (<100 мкл) слюны, высушенной воздухом на микрофлюидном устройстве.Мы оценили работу устройства с использованием образцов искусственной слюны и слюны человека и обнаружили, что устройство показало точность >99% в эффективном прогнозировании овуляции.

Graphical Abstract

Недорогой, быстрый, автоматизированный микрочип на базе смартфона для тестирования овуляции путем обнаружения структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны с использованием искусственного интеллекта.

Введение

Планирование семьи укрепляет права людей определять количество детей и интервалы между их рождением.Время полового акта по отношению к овуляции сильно влияет на вероятность успешного зачатия и может быть эффективным методом естественного планирования семьи ¹ . Почти 44% всех беременностей во всем мире являются незапланированными или непреднамеренными ^{2, 3} . Непреднамеренная беременность может иметь неблагоприятные последствия для здоровья как матери, так и ребенка и сопряжена со значительным экономическим и социальным бременем. Кроме того, только в 2010 году расходы на роды, аборты и выкидыши в результате незапланированной беременности составили более 21 миллиарда долларов государственных средств в США ^{4, 5} .Исследование также показало, что услуги по планированию семьи сами по себе помогли снизить число нежелательных беременностей и связанные с этим расходы почти на 70% ^{5, 6} . Простой недорогой инструмент, который может помочь в планировании семьи, поможет женщинам избежать нежелательной беременности и будет иметь большое значение для тех пациенток, которые пытаются зачать ребенка.

Естественное планирование семьи использует физические признаки, симптомы и физиологические изменения для прогнозирования фертильности женщины ^{7, 8} . Некоторые из методов мониторинга женской фертильности включают обнаружение овуляции посредством определения уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ), оценку активности бета-глюкуронидазы в слюне, ректальный или оральный анализ базальной температуры тела, характеристику цервикальной слизи и анализ слюнного папоротника ⁹ .Анализ слюнных папоротников относительно недорог и прост, что делает его привлекательной альтернативой большинству доступных подходов ¹⁰ . Во время фолликулярной фазы менструального цикла с повышением уровня эстрадиола в крови происходит увеличение электролитов слюны, что приводит к стойкому папоротниковому виду, кристаллизованной структуре, напоминающей листья папоротника, в высушенной на воздухе слюне и может быть использовано для определить период овуляции ^{10, 11} . Структуры папоротника наблюдались у овулирующих женщин в течение 4-дневного окна около дня овуляции ¹² .Тем не менее, современные тесты на овуляцию, основанные на слюнном папоротнике, являются ручными и очень субъективными, что вызывает неправильную интерпретацию, когда их выполняет непрофессиональный потребитель ¹³ .

Искусственный интеллект (ИИ) получает признание в медицине, и одним из основных его применений в здравоохранении является его способность точно интерпретировать сложные медицинские данные со сверхчеловеческой точностью и последовательностью ¹⁴ . Уже было показано, что ИИ исключительно хорошо работает в таких приложениях, как прогнозирование риска сердечно-сосудистых заболеваний ¹⁵ , скрининг рака кожи ¹⁶ и обнаружение диабетической ретинопатии ¹⁷ .Достижения в области микроэлектроники и машинного обучения позволили современным методам, основанным на искусственном интеллекте, одинаково хорошо работать на портативных системах, особенно на смартфонах. Смартфонами пользуются более 4,4 миллиарда человек по всему миру, что делает их отличным кандидатом на разработку технологий для оказания медицинской помощи ¹⁸ . Фактически, камеры смартфонов использовались в тестах по месту оказания медицинской помощи как для качественного, так и для количественного определения клинически значимых биомаркеров для выявления заболеваний или мониторинга лечения, таких как выявление ВИЧ/СПИДа и сифилиса ^19–21 , герпеса ²² , серповидноклеточная анемия ²³ , мужское бесплодие ^24–29 и Зика ^{30, 31} .

Здесь мы сообщаем о простом, недорогом и автоматизированном устройстве на базе смартфона для тестирования овуляции по месту оказания медицинской помощи, которое использует искусственный интеллект для точного обнаружения паттернов папоротника в небольшом объеме (~ 100 мкл) воздушно-сухой слюны. образцы помещают на микрожидкостное устройство (). Мы использовали нейронную сеть для быстрого (менее 31 секунды) анализа и обнаружения папоротников в высушенных на воздухе образцах слюны. Нейронная сеть использует архитектуру MobileNet, предварительно обученную на 1,4 миллионах изображений ImageNet и повторно обученную на изображениях слюнных папоротников.Устройство на базе смартфона смогло определить овуляцию с точностью 99,5% при тестировании 200 изображений человеческой слюны, собранных во время овуляционных и неовуляционных фаз менструального цикла у 6 женщин.

Этапы проведения теста слюнного папоротника на основе смартфона.

(A) Слюну собирают на микрожидкостном устройстве, смазывают тампоном и оставляют для сушки на воздухе. (B) Оптическая система подключена к совместимому смартфону для тестирования.(C) Микрожидкостное устройство с высушенным на воздухе образцом вставляется в оптическую насадку, и тест инициализируется с помощью разработанного пользовательского приложения для Android. (D) Программное обеспечение анализирует образец папоротника, демонстрируемый высушенными на воздухе образцами слюны, и определяет, находится ли субъект в овуляционной или неовуляционной фазе менструального цикла.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Целью данного исследования была разработка автоматизированного устройства для определения овуляции у женщин с помощью теста слюнного папоротника.В исследовании приняли участие 6 здоровых женщин в возрасте от 20 до 22 лет. Субъекты были отобраны на основе следующих критериев: 1) у них в анамнезе были нормальные менструальные циклы; 2) Они не употребляли табак и алкоголь и 3) Они не использовали гормональную контрацепцию в течение периода исследования. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Набранные субъекты предоставили информированное согласие до сбора образцов слюны.Каждому испытуемому давали микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл для сбора образца рано утром перед чисткой зубов. Образцы слюны собирали во время овуляционных и неовуляционных фаз. Две различные фазы были идентифицированы с использованием теста мочи Clear Blue ^® (ЛГ + эстроген) в качестве эталона. Образцы загружали в микрожидкостное устройство и анализировали с помощью оптической системы на базе смартфона. Также был проведен ручной анализ на наличие слюнного папоротника с использованием микроскопа на этапе обучения сети.

Оптическая насадка

Для проведения этого исследования мы разработали оптическую насадку для смартфона (83 × 97 × 74 мм), которая была напечатана на 3D-принтере с помощью Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и полимолочной кислоты (PLA) (Ultimaker). печатный материал (). Оптическая схема прибора содержала плосковыпуклую линзу диаметром 9 мм с фокусным расстоянием 13,5 мм для увеличения и стандартную акриловую линзу диаметром 12 мм с фокусным расстоянием 30 мм в качестве конденсора. Объективы были совмещены с оптической осью фронтальной камеры смартфона.Насадка была разработана в SolidWorks (Dassault Systèmes) для смартфона Moto X (Motorola, XT1575). Движение микрофлюидного устройства по оси X (параллельно установке линзы) было достигнуто с помощью редукторного двигателя постоянного тока 6 В, 100 об / мин (B07556CZL1, Walfront) с ходовым винтом M3, прикрепленным к валу. Устройство питалось от щелочной батареи 9 В (B000099SKB, Energizer). Для освещения микрофлюидного чипа использовали рассеянный белый светоизлучающий диод (LED) 5 В (IL153, ​​Microtivity). Одноплатный микроконтроллер (NodeMCU) использовался для управления движением микрожидкостного устройства.Принципиальная схема установки приведена в дополнительной информации (рис. S1).

Схематическое изображение оптической системы на базе смартфона и одноразового микрожидкостного устройства.

(A) Покомпонентное изображение автономной оптической системы и ее различных компонентов. Система управляется по беспроводной связи с помощью смартфона для отображения структур папоротника на микрофлюидном устройстве. (B) Фактическое изображение изготовленной автономной оптической системы со смартфоном для визуализации и анализа структур папоротника в высушенных на воздухе образцах слюны.(C) Взрыв микрофлюидного устройства с блоком мазка. (D) Фактическое микрожидкостное устройство, помещенное рядом с монетой в четверть доллара США.

Изготовление микрожидкостных устройств

Микрожидкостное устройство состояло из поли(метилметакрилата) (ПММА) (8560K239, McMaster Carr), двустороннего клея (DSA), полимолочной кислоты (PLA) и предметного стекла (VWR, 48300–025). Corning 75×25 мм). Прозрачные листы PMMA и DSA вырезали с помощью лазерного резака (VLS 2.3, Universal Laser Systems Inc.). Лазерный резак также использовался для контролируемого травления ПММА для создания канавок. Канавки были протравлены на ПММА таким образом, чтобы внутренняя сторона полностью построенного микрофлюидного чипа служила направляющими для блока мазка. Небольшой участок (25 × 12 мм ² ) был оставлен открытым на одном конце предметного стекла для работы с микрожидкостным устройством (). Одна сторона DSA была приклеена к протравленной стороне канавки ПММА, а другая сторона была приклеена к предметному стеклу, которое использовалось в качестве нижней подложки для микрочипа.Мазковый блок (12 × 8 × 9,6 мм) был напечатан с использованием 3D-принтера Ultimaker 2 Extended (Ultimaker) и PLA в качестве материала для печати. Блок мазка использовался для смазывания образца внутри канала (40 × 5 мм ² ) микрожидкостного устройства для получения контролируемой тонкой пленки слюны. Микрожидкостное устройство также имело небольшой резервуар для загрузки образца на чипе.

Приложение для Android

Приложение для Android было разработано для сбора данных изображений с помощью оптической насадки смартфона и анализа узоров папоротника, присутствующих в высушенной воздухом слюне, для прогнозирования статуса овуляции.Когда микрофлюидное устройство с загруженным образцом было вставлено в оптическую насадку, микрофлюидное устройство перемещалось параллельно установке линзы для автоматического изображения всего канала слюнного папоротника. Приложение для Android управляло двигателями через NodeMCU и, следовательно, движением микрофлюидного устройства. Беспроводная связь между смартфоном и оптической системой была достигнута за счет настройки NodeMCU в качестве веб-сервера HTTP. Приложение захватывает видеокадры микроканала со скоростью ~ 5 кадров в секунду (fps).

Видеокадры были отобраны с 4-кратным увеличением, и каждый кадр был передан в обученную сеть для обнаружения присутствия папоротника. Время вывода для получения результата для каждого кадра составило ~200 мс для смартфона Moto X и может различаться для разных смартфонов. Пользовательский интерфейс приложения для смартфона был разработан, чтобы быть простым и удобным в использовании. Кроме того, результаты сохранялись в календарном событии для отслеживания цикла овуляции. Приложение для Android автоматически захватывает видеокадры, локально анализирует изображения и сообщает результат менее чем за 31 с.Для анализа не требуется доступ в интернет.

Сбор данных

Добровольных участников попросили собрать образцы слюны рано утром перед чисткой зубов, чтобы исключить любые расхождения в концентрации электролитов в слюне из-за повседневной деятельности человека. Институциональные наблюдательные советы по исследованиям человека больницы Brigham and Women’s Hospital одобрили набор испытуемых и использование образцов слюны человека (IRB2017P002139). Мы собирали образцы каждый день у каждой участницы в течение одного полного менструального цикла и тестировали их с помощью наших микрожидкостных устройств как во время овуляционной, так и неовуляционной фаз.Мы также использовали искусственную слюну для имитации узоров папоротника для обучения и тестирования алгоритма ИИ. Мы смоделировали 30 неовулирующих образцов в диапазоне от 0,1% до 1,4% и 34 овулирующих образца в диапазоне от 5,6% до 100% запаса искусственной слюны. Образцы были подготовлены, чтобы охватить широкий спектр папоротниковых и непапоротниковых структур. Подготовленные образцы загружали в микрожидкостные устройства и размазывали по узкому каналу с помощью размазывающего блока. Образцы высушенной на воздухе слюны затем визуализировались с помощью оптической системы на базе смартфона.Всего было получено 1640 изображений из образцов слюны человека и искусственной слюны, которые были классифицированы на 476 изображений с овуляцией и 1164 изображения без овуляции на основе паттернов папоротника. Аннотации для образцов с папоротником и без папоротника были получены путем ручного осмотра смоделированных образцов под настольным микроскопом. Статус овуляции для образцов человеческой слюны был установлен с помощью анализа мочи (ЛГ + эстроген) в дополнение к ручной проверке.

Обучение MobileNet

Чтобы классифицировать структуры папоротника на смартфоне, MobileNet предварительно обучен 1.В качестве архитектуры нашей нейронной сети ³² использовалось 4 миллиона изображений ImageNet с параметром множителя ширины α=0,50 и размером изображения 224×224 пикселя. ImageNet, набор данных с открытым исходным кодом, который содержит изображения без слюны из различных категорий, помог в предварительном обучении сети. Для сложной архитектуры нейронной сети, такой как MobileNet, набора данных примерно из 1500 изображений недостаточно для оптимизации их весов во время обучения. Поэтому мы использовали разнообразный крупномасштабный набор данных, чтобы «предварительно обучить» сеть, а затем уточнить ее, чтобы она работала для нашего приложения для анализа слюнных папоротников. Используемая модель MobileNet работала с точностью 1 первого уровня 64,0% и точностью 5 топового уровня 85,4 % по 1000 классам базы данных ImageNet.

MobileNet был специально разработан для эффективного использования ограниченных ресурсов, доступных на встроенных устройствах, таких как смартфоны. Сеть использует свертки с разделением по глубине для построения облегченных глубоких нейронных сетей, в отличие от традиционных нейронных сетей свертки, которые используют стандартную двумерную свертку. Стандартная двумерная свертка применяет ядро ​​свертки ко всем каналам входного изображения.2D-свертка перемещает ядра по всем каналам входного изображения и вычисляет взвешенную сумму входных пикселей, применяемых ядром для всех входных каналов. Глубинная свертка — это пространственная разделимая свертка, выполняемая на отдельных каналах, выходные данные которой вычисляются в новый канал с помощью точечной свертки (стандартная свертка с ядром 1×1).

Структуры MobileNet были построены с помощью разделимых по глубине сверток, за исключением первого слоя, который был построен со стандартной сверткой 3×3. За каждым сверточным слоем следует выпрямленная линейная единица (ReLU) и нормализация партии. Последний уровень MobileNet содержит средний объединяющий слой для уменьшения пространственного разрешения до 1, за которым следует полносвязный слой, который был передан на наш уровень классификации для обнаружения. Выборка вниз выполнялась с помощью шаговой свертки в свертках по глубине, а также в первом слое. Вместо обучения модели с нуля была использована техника трансферного обучения. Мы использовали предварительно обученные веса MobileNet, который был обучен на ImageNet для повторного использования его возможностей извлечения признаков.Слой классификации был добавлен в конце и был обучен классифицировать образцы слюны на овулирующие и неовулирующие на основе шаблонов папоротника. Только классификационный слой был обучен, а остальные слои остались нетронутыми. Выходные данные полностью подключенного слоя оставались одинаковыми для каждого изображения, и выходные данные использовались несколько раз. Поскольку расчет результатов занимал значительное время, мы создали узкие места на выходе, чтобы сократить время обучения. Выходные данные полносвязного слоя использовались в качестве входных данных для слоя классификации.Истинные метки передавались в сеть как наземные, и вычислялись точность, перекрестная энтропия и градиенты ().

Графическое изображение потока данных с обучающими и проверочными кривыми для точности и перекрестной энтропии.

(A) Вычислительный поток данных. (B) Набор данных папоротниковых и непапоротниковых изображений был обучен и проверен на более чем 4000 тренировочных шагов со скоростью обучения 0,01. К 4000-му шагу обучения точность проверки и потеря перекрестной энтропии достигли предела.

Эффективность обучения измерялась перекрестной энтропией, которая использовалась в качестве функции потерь, чтобы узнать, насколько хорошо сеть обучается. Точность обучения — это процент правильно помеченных изображений в обучающем пакете, а точность проверки — это процент правильно помеченных изображений, отличных от изображений в обучающем пакете. Разница между двумя точностями использовалась для определения того, является ли модель переоснащением.

Для трансферного обучения мы повторно обучили MobileNet, предварительно обученную на ImageNet, для 4000 обучающих шагов (эпох) со скоростью обучения, установленной на 0.01 с использованием наших наборов данных слюны. Вес модели, достигший наименьшей потери перекрестной энтропии, сохранялся и использовался. На 1000 ^-м шаге обучения потеря перекрестной энтропии при проверке составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45% (). В рамках процесса обучения размеры всех изображений, используемых во время обучения, были изменены до 224×224 пикселей с использованием библиотек компьютерного зрения (OpenCV) и обучены в среде TensorFlow. Обученная таким образом нейронная сеть выполняла всю обработку и анализ локально, без необходимости доступа к Интернету.

Методы визуализации данных

Карты значимости были созданы с использованием TensorFlow. SmoothGrad, примененный к выходным данным, полученным из полносвязного слоя свертки, использовался для повышения резкости карт чувствительности на основе градиента ^{33, 34} . Мы сопоставили активации слоя активации сразу после полносвязного слоя свертки. При создании карт заметности использовались изображения как искусственной слюны, так и изображений тестового набора слюны человека. Встраивание стохастических соседей по t-распределению (t-SNE) было выполнено для наблюдения за распределением набора тестовых данных в 2D-пространстве и для проверки того, способна ли наша модель точно различать овулирующие и неовулирующие образцы.

Искусственная слюна

Искусственная слюна использовалась для имитации папоротников. Состав искусственной слюны следующий: 0,92 г/л ксантановой камеди (Q8185, MP Biomedicals), 1,2 г/л хлорида калия (L1117, Chemcruz), 0,85 г/л хлорида натрия (031M0215V, Sigma), 0,05 г. л хлорида магния (030M0060V, Sigma), 0,13 г/л хлорида кальция (057K0005, Sigma), 0,13 г/л дикалия гидроортофосфата (SLBS6839, Sigma) и 0,35 г/л метил-п-гидроксибензоата (Q7915, MP биомедицинские препараты).рН искусственно приготовленной слюны составлял 7,0. pH нормальных образцов слюны колеблется от 6,2 до 7,6. Мы подготовили исходный раствор и разбавили его деионизированной водой, чтобы имитировать образцы слюны, полученные от овулирующих и неовулирующих людей. Ниже приводится разбивка концентраций искусственной слюны, показывающая три фазы папоротника: непапоротниковый — от 0,1% до 1,4%, переходный — от 1,5% до 5,6% и папоротниковый — от 5,6% до 100% приготовленного запаса искусственной слюны.

Результаты

Характеристика оборудования для анализа овуляции на основе смартфона

Система тестирования овуляции на основе смартфона была разработана таким образом, чтобы быть простой и с минимальным вмешательством пользователя (, ).Аппаратные компоненты системы состояли из оптической насадки для смартфона для увеличения изображения образца и микрожидкостного устройства для работы с образцом слюны (, ). Оптическая насадка для смартфона, напечатанная на 3D-принтере, была легкой (208 г) и компактной (83 × 70 × 74 мм). Он использовал переднюю камеру смартфона для изображения и был прикреплен к телефону с помощью простого надвижного механизма. Увеличение изображения, достигнутое системой смартфона, составило 4×, что было сравнимо с цифровыми изображениями, полученными с помощью стандартного лабораторного микроскопа (Carl Zeiss AG Axio Observer D1) при 10-кратном увеличении.Эффективное поле зрения системы составляло 2,19 × 2,95 мм. Отображая микрометровый масштаб с помощью оптической системы, мы заметили, что 1 мкм на записанном изображении представлен 0,226 пикселями (рис. S2A), однако разрешение оптической системы сотового телефона составляло 7 мкм, что было установлено при отображении изображения 1951 года. Целевое разрешение ВВС США (USAF) (рис. S2B). Система была моторизована вдоль одной оси и фокальной плоскости для автоматизации визуализации микрожидкостного канала. Микрожидкостное устройство, содержащее образец слюны, было оптимально сфокусировано путем размещения устройства на рабочем расстоянии от установки линзы, что помогло исключить ручную фокусировку пользователем.Общая стоимость материала для изготовления аксессуара для смартфона и микрофлюидного устройства составила 13,91 доллара США, включая 13,58 доллара США на оптическую насадку и 0,33 доллара США на микрофлюидное устройство (таблица S1). Приложение для смартфона было разработано, чтобы направлять пользователя на каждом этапе тестирования (рис. S3). Разработанная система записывала видео со скоростью ~ 5 кадров в секунду, покрывая площадь 2,1 × 22,6 мм ² микрофлюидного устройства за <31 секунду на образец, в течение которых приложение для смартфона отображало, локально анализировало и сообщало результат.

Микрожидкостное устройство для работы с образцами

Микрофлюидное устройство было разработано с резервуаром для загрузки образца слюны и узким микроканалом для визуализации воздушно-сухого образца. Образец слюны наносится на зону визуализации устройства с помощью простого накладного блока, напечатанного на 3D-принтере ()

. Среднее время высыхания образца слюны на микрожидкостном устройстве составило 6,7 ± 1,5 минуты по сравнению с минимальными 25 минутами. на обычном предметном стекле (n=8, по 3 повторности) (рис.С4). Был проведен регрессионный анализ методом наименьших квадратов, и наклоны линий для микрожидкостных устройств и групп предметных стекол составили 0,008 (95% доверительный интервал: от -0,003 до 0,02) и 0,52 (95% доверительный интервал: 0,29 до 0,74) со значениями R ² 0,30 и 0,97 соответственно (рис. S4). При размазывании образца создается тонкая пленка на стеклянной подложке микрофлюидного устройства, что минимизирует время высыхания образца независимо от его объема.

Работа системы в искусственной слюне

Образцы искусственной слюны использовались для обучения нейронной сети.Используя 492 аннотированных изображения, состоящих из 168 изображений с узорами папоротника и 324 изображений без узоров папоротника, мы переобучили и проверили нашу модель для классификации изображений на две категории образцов с овуляцией и без овуляции. Способность переобученной модели MobileNet предсказывать правильный результат оценивалась с использованием 100 изображений с паттернами папоротника и 100 изображений без паттернов папоротника смоделированной искусственной слюны. Эффективность сети при оценке высушенных на воздухе образцов слюны составила 90% с 95% доверительными интервалами (ДИ), которые варьировались от 84.от 98% до 93,78% (, S5A). Сеть работала с чувствительностью 97,62% (ДИ: от 91,66% до 99,71%) и специфичностью 84,48% (ДИ: 76,59% до 90,54%) (, S5A) при оценке образцов папоротника искусственных образцов слюны. Для данного набора тестов положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) системы составляли 82% (ДИ: от 74,85% до 87,46%) и 98% (ДИ: 92,56% до 99,48%) соответственно ( , С5А). График t-SNE был создан для визуализации степени разделимости данных в двумерном пространстве ().Между двумя образцами наблюдалась хорошая степень разделения.

Производительность системы с образцами искусственной и человеческой слюны вместе с визуализацией TSNE.

(A) Точечный график иллюстрирует эффективность системы при оценке высушенных на воздухе образцов искусственной слюны (n = 200). (B) График иллюстрирует производительность системы при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека (n = 200). Квадраты представляют собой истинные метки, а кружки внутри них представляют собой классификацию системы.Синие квадраты и кружки представляют образцы слюны без овуляции, а красные квадраты и кружки представляют образцы слюны с овуляцией. (C) Диаграмма рассеивания помогает визуализировать разделение овулирующих и неовулирующих образцов на основе структур папоротника, представленных высушенными на воздухе образцами искусственной и человеческой слюны. Карта заметности была извлечена из сети, чтобы выделить наиболее взвешенные функции изображения. Черный цвет обозначает функции с наименьшим весом, а белый цвет указывает на функции с наибольшим весом на изображении.

Работа системы с человеческой слюной

Мы также оценили способность системы различать овулирующие и неовулирующие образцы человеческой слюны. Женщины (n = 6) собирали и тестировали образцы своей слюны с помощью системы мобильного телефона во время овуляционной и неовуляционной фаз менструального цикла, и результаты были подтверждены с помощью анализа мочи Clear Blue ^® (LH + эстроген). Испытуемых просили плюнуть на резервуар микрофлюидного устройства и намазать его на микроканал для просушки воздухом.Используя дополнительные 748 аннотированных изображений образцов слюны человека, состоящих из 108 изображений с овуляцией и 640 изображений без овуляции, полученных от субъектов (n = 6), мы переобучили и проверили разработанную нейронную сеть. Вся сеть была обучена 4000 тренировочным шагам со скоростью обучения 0,01, при использовании которой были достигнуты самые низкие проверочные веса. На 1000 ^-м шаге обучения перекрестная энтропия проверки составила 0,1177, а точность проверки составила 97,45%. На 4000 ^-м -м шаге обучения мы заметили, что точность осталась неизменной без снижения перекрестной энтропийной потери.Между кривыми точности обучения и проверки была небольшая предельная разница, указывающая на то, что модель не была переоснащена (). Способность переобученной модели MobileNets предсказывать правильный результат оценивалась с использованием набора из 100 изображений с узорами папоротника и 100 изображений без узоров папоротника. Точность нейронной сети в прогнозировании образца слюны как овулирующей и неовулирующей составила 99,5% с ДИ в диапазоне от 97,25% до 99,99% (, S5B). Чувствительность и специфичность системы смартфонов с искусственным интеллектом при оценке высушенных на воздухе образцов слюны человека составила 99.01% (ДИ: от 94,61% до 99,97%) и 100% (ДИ: 96,34% до 100%) соответственно (, S5B). Мы выполнили t-SNE, чтобы визуализировать разделение набора данных сетью в 2D-пространстве (). Увидев отличное разделение между двумя классами, мы дополнительно исследовали сеть, сопоставив последние слои активации, чтобы визуализировать значимость. С помощью карт заметности ³⁴ мы смогли определить пиксели, которые используются сетью, и подтвердили, что она сосредоточилась на функциях, относящихся к шаблону папоротника в процессе принятия решений ().PPV и NPV системы для данного тестового набора составили 100% и 99,0% (ДИ: от 93,37% до 99,86%) соответственно.

Адаптируемость системы к различным смартфонам

Чтобы оценить возможность обобщения разработанного алгоритма искусственного интеллекта на устройства и системы визуализации, мы протестировали высушенные на воздухе образцы искусственной слюны с различными концентрациями аналитов, представляющих фазы овуляции и неовуляции, с использованием 5 разных смартфонов. В этом исследовании мы использовали Samsung Galaxy 5, Xiaomi Redmi Note 4, OnePlus 5T, LG G6 и Moto X.Использовался базовый алгоритм, обученный как на изображениях воздушно-сухих образцов искусственной слюны, так и на образцах слюны человека, полученных с помощью устройства Moto X, и никакого дополнительного обучения для адаптации сети к тестируемым устройствам не проводилось. Сеть работала с отличной согласованностью на всех протестированных устройствах, получив отличную оценку 1,0 (нижний 95% ДИ: 1,0) в альфа-тесте Кронбаха на согласованность (n = 15 с 5 телефонами) (таблица S2). Эти результаты показывают, что разработанная сеть хорошо обобщается для различных смартфонов, протестированных в этом исследовании.

Обсуждение

Точное определение овуляции полезно при планировании семьи. Текущий домашний тест мочи выявляет внезапный всплеск ЛГ, что помогает определить фазу овуляции. Хотя ЛГ в моче легко проверить, люди из менее развитых стран не имеют доступа к этим относительно дорогим наборам для тестирования. Кроме того, тест на папоротник может быть более надежным у пациенток с ложноположительными реакциями на набор для определения ЛГ в моче, например у женщин с синдромом поликистозных яичников и повышенным уровнем ЛГ.В настоящее время тесты слюнного папоротника проводятся с использованием капли подъязычного образца слюны, помещенной на предметное стекло, которую затем сушат и вручную тестируют на папоротниковые структуры ³⁵ . Ручное тестирование очень субъективно и может привести к неправильной интерпретации результатов неспециалистами.

Мы разработали автоматизированную оптическую систему на базе смартфона, которая может точно определять овуляцию у женщин, используя небольшой объем (<100 мкл) высушенных на воздухе образцов слюны, загруженных в микрофлюидное устройство, посредством обнаружения папоротника слюны с помощью анализа на основе искусственного интеллекта по телефону. .Наше микрожидкостное устройство обеспечивает быстрое (<7 минут) высыхание образца слюны за счет создания тонких пленок и обеспечивает контролируемый объем образца для анализа. Традиционные методы точечного размещения не контролируют объем образца и, таким образом, часто имеют тенденцию вызывать ложный сигнал.

Хотя контроль объема образца слюны достигается в микрожидкостном устройстве, мы заметили, что узоры папоротника не одинаково распространены по всему микроканалу, а обнаруживаются в виде пакетов. Вероятно, это связано с перераспределением растворенного вещества в микрофлюидном устройстве во время формирования тонких пленок в сочетании с неравномерным испарением.В таком случае для точного предсказания узоров папоротника мы визуализировали весь микроканал, чтобы убедиться, что все узоры папоротника на микрофлюидном устройстве были захвачены и проанализированы. Точность системы при классификации образцов слюны и обнаружении структур папоротника в неразбавленных, необработанных образцах слюны составила 99,5% (). Оптический фокус и равномерная интенсивность света были зафиксированы в оптической системе, чтобы избежать ошибок ручной настройки.

Разработанная система визуализации может быть использована для других приложений, которые включают визуализацию микроструктур в освещенной среде, например, для обнаружения структур папоротника в амниотической жидкости для диагностики преждевременного разрыва плодных оболочек (PROM) у беременных женщин ³⁶ и слезной пленки для обнаружения болезнь сухого глаза ³⁷ .Разрыв плодных оболочек (ПЗУ) – разрыв амниотического мешка, происходящий до начала родов ³⁶ . С другой стороны, болезнь сухого глаза диагностируется путем проверки глазной слезной пленки на наличие узоров папоротника. Образцы здоровой слезы образуют плотные узоры папоротника, которые отсутствуют в образцах сухого глаза ³⁷ .

Экспресс-тест на овуляцию по месту оказания медицинской помощи также имеет важное применение в животноводстве. Разведение животных в основном зависит от цикла размножения вида и ограничено во времени.Одним из важных критериев разведения животных является определение оптимального времени разведения животного для достижения более высокой степени оплодотворяемости. Для яйцеклетки, оплодотворенной в более позднем возрасте, шансы на аборт выше. Поэтому существует необходимость в расширенном прогнозировании овуляции. Разработанная автоматизированная оптическая система на основе смартфона потенциально может быть использована для анализа моделей выделения слюны у животных, таких как буйволы ³⁸ , собаки ³⁹ и других млекопитающих, для прогнозирования и подтверждения их овуляции и определения оптимального времени осеменения.Чтобы определить время осеменения, многие заводчики животных полагаются на ручные методы, такие как индикация охоты, но это не всегда точно; овуляция может происходить до, во время или после видимой течки ⁴⁰ . Другие устройства, такие как электронные шагомеры или метки активности, используются для обнаружения овуляции путем отслеживания изменений в поведении, таких как беспокойство, стоячая течка, поведение вскакивания и повышенная физическая активность животных ⁴¹ . Некоторые животные чувствительны к этим типам измерений, и животноводам становится трудно проверять их с помощью этих методов.Чтобы исключить такие осложнения, необходима регулярная, доступная и удобная система определения овуляции для эффективного управления разведением животных.

Одним из основных преимуществ указанного подхода по сравнению со всеми другими доступными методами является его экономическая эффективность в долгосрочной перспективе ¹⁰ . Общая стоимость материала для нашего подхода составляет ~ 14 долларов США, и его можно полностью использовать повторно. Тесты на основе мочи могут стоить от 1 до 2 долларов за тест, однако они не подлежат повторному использованию, и, таким образом, за цикл общий тест может стоить примерно 35-40 долларов для пользователя в США.Согласно предыдущим отчетам, большинство женщин беременеют в течение 6 циклов, поэтому, по нашим оценкам, эти одноразовые тесты могут в совокупности стоить более 200 долларов США для большинства женщин ⁴² . Следует отметить, что прямое сравнение затрат, связанных с анализами мочи и тестированием слюны на основе ИИ, ограничено, поскольку заявленные нами материальные затраты не включают затраты, связанные с коммерциализацией продукта и каналами сбыта. Кроме того, поскольку он выполняет весь необходимый анализ на телефоне без необходимости в Интернете, он особенно привлекателен для использования в условиях ограниченных ресурсов.

Одним из ограничений разработанной оптической системы на базе смартфона является обнаружение овуляции у женщин с дисбалансом эстрогенов, кистами в яичниках и у тех, кто принимает лекарства от бесплодия. Кроме того, после курения или употребления алкоголя следует обеспечить достаточный промежуток времени перед тестированием. Если на эти состояния не обращать должного внимания, они могут вызвать папоротникообразные структуры при отсутствии овуляции. Наша система может определить все фертильное окно, включая точный день овуляции, когда шансы на зачатие выше.Кроме того, включение базальной температуры тела может помочь в преодолении текущих ограничений системы и, таким образом, требует дальнейших исследований. Продемонстрированная здесь работа является примером того, как искусственный интеллект, интегрированный со смартфонами вместе с недорогим оборудованием, может быть преобразован в эффективный диагностический анализ по месту оказания медицинской помощи, который может удовлетворить потребность в домашнем управлении фертильностью и планировании семьи.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Снеху Сундар и Фенила Доши за продуктивные обсуждения.Эта работа частично поддерживается экспериментальным грантом Исследовательского института Бригама, Инновационным вечнозеленым фондом (Исследовательский институт Бригама, Больница Бригама и женщин, Гарвардская медицинская школа), 1R01AI118502 и P30ES000002, R21HD092828 (Национальный институт здравоохранения) и Гарвардским национальным институтом гигиены окружающей среды. Научный грант (Гарвардская школа общественного здравоохранения им. Т. Х. Чана, Гарвардский центр гигиены окружающей среды) и Премия Американского общества репродуктивной медицины (Американский совет акушерства и гинекологии, Американский колледж акушеров и гинекологов, Американское общество репродуктивной медицины и Общество Репродуктивная эндокринология и бесплодие).

Сноски

Конфликт интересов

У авторов нет конфликтов интересов, о которых следует заявить.

Ссылки

1. Wilcox AJ, Weinberg CR and Baird DD, New England Journal of Medicine, 1995, 1517–1521. [PubMed] [Google Scholar]4. Сонфилд А., Хастедт К. и Голд Р.Б. Движение вперед: планирование семьи в эпоху реформы здравоохранения, Институт Гуттмахера, Нью-Йорк, 2014 г. [Google Scholar]5. Сонфилд А. и Кост К., Государственные расходы в связи с незапланированной беременностью и роль программ государственного страхования в оплате медицинских услуг, связанных с беременностью: оценки по стране и штату за 2010 г., Институт Гуттмахера, Нью-Йорк, 2015 г.[Google Академия]6. Frost JJ, Frohwirth LF and Zolna MR, Contraceptive Needs and Services, Update 2014, Guttmacher Institute, New York, 2016. [Google Scholar]7. Стэнфорд Дж. Б., Лемэр Дж. К. и Турман П. Б., Журнал семейной практики, 1998, 46, 65–71. [PubMed] [Google Scholar]8. Паллоне С.Р. и Бергус Г.Р., Журнал Американского совета семейной медицины: JABFM, 2009, 22, 147–157. [PubMed] [Google Scholar]9. Guida M, Tommaselli GA, Pellicano M, Palomba S и Nappi C, Гинекологическая эндокринология: официальный журнал Международного общества гинекологической эндокринологии, 1997, 11, 203–219.[PubMed] [Google Scholar] 11. Эрсиари Р.М., Вихарджа Р. и Дарджан М., Стоматологический журнал Паджаджаран, 2014, 26, 194–202. [Google Академия] 12. Salmassi A, Schmutzler AG, Püngel F, Schubert M, Alkatout I и Mettler L, Gynecologic and Obstetric Investigation, 2013, 76, 171–176. [PubMed] [Google Scholar] 13. Guida M, Tommaselli GA, Palomba S, Pellicano M, Moccia G, Di Carlo C и Nappi C, Fertility and стерильность, 1999, 72, 900–904. [PubMed] [Google Scholar] 15. Поплин Р., Варадараджан А.В., Блумер К., Лю Ю., МакКоннелл М.В., Коррадо Г.С., Пэн Л. и Вебстер Д.Р., Nature Biomedical Engineering, 2018, 2, 158–164.[Google Академия] 17. Гульшан В., Пэн Л., Корам М., Стамп М.С., Ву Д., Нараянасвами А., Венугопалан С., Виднер К., Мадамс Т., Куадрос Дж., Ким Р., Раман Р., Нельсон П.С., Мега Дж.Л. и Вебстер Д.Р., Джама, 2016, 316 , 2402–2410. [PubMed] [Google Scholar] 18. Jonsson P, Carson S, Sethi JS, Arvedson M, Svenningsson R, Lindberg P, Öhman K and Hedlund P, Ericsson Mobility Report, Ericsson, Стокгольм, Швеция, 2017 г. [Google Scholar]19. Канакасабапати М.К., Пандья Х.Дж., Драз М.С., Чуг М.К., Садасивам М., Кумар С., Этемад Б., Йогеш В., Сафави М., Асгар В., Ли Дж.З., Цибрис А.М., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., Лаборатория на чипе, 2017, 17 , 2910–2919.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]20. Лаксанасопин Т., Го Т.В., Наяк С., Шридхара А.А., Се С., Оловукере О.О., Кадину П., Мэн Ф., Чи Н.Х., Ким Дж., Чин К.Д., Муньязеса Э., Мугванеза П., Рай А.Дж., Мугиша В., Кастро А.Р., Штайнмиллер Д. , Линдер В., Джастман Дж. Э., Нсанзимана С. и Сиа С. К., Science Translational Medicine, 2015, 7, 273re271. [PubMed] [Google Scholar] 21. Драз М.С., Кочебйоки К.М., Васан А., Батталапалли Д., Шрирам А., Канакасабапати М.К., Каллакури С., Цибрис А., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., Nature Communications, 2018, 9, 4282.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]22. Берг Б., Кортазар Б., Ценг Д., Озкан Х., Фенг С., Вэй К., Чан Р.И.-Л., Бурбано Дж., Фаруки К., Левински М., Ди Карло Д., Гарнер О.Б. и Озкан А., ACS Nano, 2015, 9, 7857 –7866. [PubMed] [Google Scholar] 24. Тирумалараджу П., Борман К.Л., Канакасабапати М., Доши Ф., Сутер И., Димитриадис И. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2018, 110, e432. [Google Академия] 25. Димитриадис И., Сюй Р., Канаксабапати М.К., Тирумалараджу П., Йогеш В., Танрикут С., Хсу Дж., Борман С.Л. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2018, 109, e24.[Google Академия] 26. Канакасабапати М., Тирумалараджу П., Йогеш В., Натараджан В., Борман К.Л., Петроцца Дж.К. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017 г., 108, e74–e75. [Google Академия] 27. Kanakasabapathy MK, Sadasivam M, Singh A, Preston C, Thirumalaraju P, Venkataraman M, Bormann CL, Draz MS, Petrozza JC and Shafiee H, Science Translational Medicine, 2017, 9. [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Канакасабапати М., Тирумалараджу П., Йогеш В., Натараджан В., Борман К.Л., Бхоумик П., Вейга С., Петроцца Дж.С. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017, 108, e74.[Google Академия] 29. Борман К.Л., Канакасабапати М., Тирумалараджу П., Йогеш В., Натараджан В., Демик Дж., Бланшар А., Петроцца Дж.К. и Шафи Х., Фертильность и бесплодие, 2017, 108, e74. [Google Академия] 30. Драз М.С., Лакшминараасимулу Н.К., Кришнакумар С., Батталапалли Д., Васан А., Канакасабапати М.К., Шрирам А., Каллакури С., Тирумалараджу П., Ли И., Хуа С., Ю К.Г., Курицкес Д.Р. и Шафи Х., ACS Nano, 2018, 12, 5709 –5718. [Google Академия] 32. Ховард А.Г., Чжу М., Чен Б., Калениченко Д., Ван В., Вейанд Т., Андреетто М. и Адам Х., ArXiv e-prints, 2017.[Google Академия] 33. Смилков Д., Торат Н., Ким Б., Виегас Ф., Ваттенберг М., Электронные отпечатки ArXiv, 2017. [Google Scholar]34. Симонян К., Ведальди А., Зиссерман А., ArXiv e-prints, 2013. [Google Scholar]35. Гюнтер В., Бауэр И., Хеддерих Дж., Меттлер Л., Шуберт М., Маккеленберг М.Т., Маасс Н. и Алкатаут И., Европейский журнал акушерства, гинекологии и репродуктивной биологии, 2015, 194, 38–42. [PubMed] [Google Scholar] 37. Масмали А.М., Пурслоу С. и Мерфи П.Дж., Клиническая и экспериментальная оптометрия, 2014 г., 97, 399–406.[PubMed] [Google Scholar] 38. Равиндер Р., Кайпа О., Баддела В.С., Сингхал Синха Э., Сингх П., Наян В., Велагала С.С., Байталу Р.К., Онтеру С.К. и Сингх Д., Териогенология, 2016, 86, 1147–1155. [PubMed] [Google Scholar] 39. Пардо-Кармона Б., Мояно М.Р., Фернандес-Паласиос Р. и Перес-Марин К.С., Журнал практики обращения с мелкими животными, 2010 г., 51, 437–442. [PubMed] [Google Scholar]41. Løvendahl P и Chagunda MGG, Journal of Dairy Science, 2010, 93, 249–259. [PubMed] [Google Scholar]42. Гнот С., Годехардт Д., Годехардт Э., Франк-Херрманн П. и Фрейндл Г., Репродукция человека, 2003, 18, 1959–1966.[PubMed] [Google Scholar]

Клиническая эпидемиология и глобальное здравоохранение

Если вы не помните свой пароль, вы можете сбросить его, введя свой адрес электронной почты и нажав кнопку «Сбросить пароль». Затем вы получите электронное письмо, содержащее безопасную ссылку для сброса пароля

Если адрес совпадает с действительной учетной записью, на адрес __email__ будет отправлено электронное письмо с инструкциями по сбросу пароля

Клиническая эпидемиология и глобальное здравоохранение

Если вы не помните свой пароль, вы можете сбросить его, введя свой адрес электронной почты и нажав кнопку «Сбросить пароль».Затем вы получите электронное письмо, содержащее безопасную ссылку для сброса пароля

Если адрес совпадает с действительной учетной записью, на адрес __email__ будет отправлено электронное письмо с инструкциями по сбросу пароля

.

Тест по слюне на овуляцию: Тест на овуляцию по слюне микроскоп Цикл с тест полосками по выгодной цене