Пигментная дегенерация сетчатки глаза: Пигментная дегенерация сетчатки

По мере того, как количество инъекций заметно увеличилось, врачи все чаще сталкиваются с вопросом о профилактике или лечении разрывов РПЭ после их образования. Эволюция визуализации сетчатки в значительной степени способствовала лучшему пониманию развития слезы РПЭ и оказалась ценным инструментом в адаптации режимов терапии у пациентов с ПЭП.

В этом обзоре освещаются текущие знания о развитии слезы RPE, прогностические факторы, указывающие на надвигающийся разрыв RPE, а также стратегии лечения до и после образования слезы RPE.

Эпидемиология

Слезы РПЭ впервые были описаны в 1981 г. Hoskin et al. [4] как осложнение у пациентов с ПЭД вследствие ВМД. Слезы РПЭ могут быть либо частью естественного течения PED из-за скрытой CNV, ангиоматозной пролиферации сетчатки или полипоидальной хориоидальной васкулопатии, либо они могут возникать в сочетании с различными методами лечения неоваскулярной AMD, такими как фотодинамическая терапия, лазерная фотокоагуляция или транспупиллярная термотерапия [5 , 6,7].

Сообщается, что заболеваемость среди пожилых людей составляет от 5 до 27% [1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 , 18,19,20,21].Casswell et al. [1] сообщили о 10% спонтанном разрыве сосудистых ПЭП. В сегодняшней клинической практике большинство слезы RPE, по-видимому, тесно связано с лечением против VEGF, и сообщалось о веществах пегаптаниб, бевацизумаб, ранибизумаб и афлиберцепт [8,9,10,11]. Первое описание разрыва RPE после интравитреальной инъекции бевацизумаба для лечения скрытой CNV, вызванной AMD, было сообщено Meyer et al. [12] в 2006 году.

Сообщается о различных случаях разрыва РПЭ при различных лечебных средствах и различных схемах лечения [13,14,15,16,17,18,19,20,21,22].Ретроспективное исследование 1280 глаз, получавших бевацизумаб, включало 125 глаз с васкуляризованным PED (vPED), показавшее скорость разрыва RPE 16,8% [13]. В серии случаев из 6 пациентов с vPED Chang et al. [14] сообщили о 27% случаев слезотечения при лечении пегаптанибом. Clemens et al. [15] сообщили о 25% случаев разрыва в проспективном исследовании ежемесячного режима приема ранибизумаба у 40 пациентов с vPED. Недавно Sarraf et al. [16] представили результаты проспективного рандомизированного исследования 0.Терапия ранибизумабом в дозе 5 или 2,0 мг на основе ежемесячного режима или режима pro re nata для глаз с vPED, частота которой составила 14% (5/37 пациентов). Интересно, что 4 из 5 случаев разрыва РПЭ произошли в группе, принимавшей высокие дозы. За исключением нескольких сообщений о случаях, пока нет доступных проспективных данных о скорости разрыва РПЭ у пациентов с вПЭД, получающих афлиберцепт [11]. Имеется единичный случай развития слезы из-за RPE в необработанном парном глазу после терапии анти-VEGF для лечения неоваскулярной AMD.Причинная связь остается умозрительной [23].

Зарегистрированные в литературе случаи разрыва РПЭ следует интерпретировать осторожно, поскольку основные группы пациентов, схемы лечения, а также номенклатура морфологии поражения имеют тенденцию быть очень неоднородными. Тем не менее, более высокая частота слезотечения РПЭ в глазах при терапии анти-VEGF по сравнению с исследованиями естественного анамнеза глаз, полученными на основе PED, свидетельствует об усилении действия агентов против VEGF на развитие слезы RPE. Предположительно, сравнительные проспективные исследования не будут проводиться в ближайшем будущем по этическим причинам.

Визуализация

Цветная фотография глазного дна

При использовании глазного дна можно заподозрить разрыв РПЭ на основании наличия субретинальной и суб-РПЭ крови, часто четко выраженной гиперпигментированной линии на месте свернутого РПЭ и депигментированной области соответствующий обнаженной сосудистой оболочке [4]. Сетчатые или субретинальные кровоизлияния четко отличимы от участков слезы РПЭ на цветной фотографии глазного дна (CFP) по сравнению с другими методами. Кровоизлияния могут помешать обнаружению области слезы РПЭ в аутофлуоресценции глазного дна (ФАФ) (рис.1а, б), что делает CFP незаменимым в этой организации.

Рис. 1

Мультимодальная визуализация типичного пациента с vPED из-за AMD после развития слезы RPE. a CFP показывает депигментированную область, соответствующую обнаженной сосудистой оболочке (звезда), и гиперпигментированную область, соответствующую зарегистрированному RPE (ромб). Обратите внимание на небольшое кровоизлияние в сетчатку, расположенное выше разрыва RPE, которое нельзя четко отличить от области гипоавтофлуоресцентного разрыва RPE в модальности FAF, как показано в b (стрелка). b Изображение cSLO FAF показывает большой, резко очерченный, гипоавтофлуоресцентный сигнал в области разрыва RPE (звездочка), а также гиперавтофлуоресцентную область, соответствующую зарегистрированному RPE (ромб). c Поздняя фаза FLA выявляет CNV в нижней части поражения (кружок) и гиперфлуоресцентный сигнал в области слезы. Примечательно, что разрыв RPE произошел на противоположной стороне от локализации CNV. d , e Комбинированное изображение cSLO в ближнем инфракрасном диапазоне ( d ) и сканирование SD-OCT ( e ), показывающее нормальную архитектуру внешних полос сетчатки в первой части.Во второй части свободный край оторванного РПЭ отводится в сторону CNV. Обратите внимание на отсутствие полосы RPE в области разрыва RPE, представляющей третью часть.

Sarraf et al. [24] представили систему оценки слезоточивости RPE, включая CFP. Разрыв 1 степени был определен как <200 мкм. Разрывы степени 2 имели диаметр от 200 мкм до 1 диска. Разрыв 3 степени был> 1 диаметра диска. Слезы 4 степени определялись как слезы 3 степени, затрагивающие центр ямки.

Автофлуоресценция глазного дна

При визуализации FAF области слезы RPE демонстрируют заметно сниженный аутофлуоресцентный сигнал, поскольку клетки RPE с флуоресцентным липофусцином теряются [25].Небольшие разрывы RPE более очевидны в FAF и их легче обнаружить, чем в CFP. Высокий контраст этих гипоавтофлуоресцентных областей по сравнению с интактной сетчаткой позволяет легко и точно определить границы поражения (рис. 1b). Конфигурация разрывов РПЭ классифицируется как однодольчатая, если области РПЭ однородно сформированы, и как многодольчатая, если дефекты РПЭ состоят из двух или более долей, разделенных куском неповрежденной нити РПЭ [26]. Со временем края гипоавтофлуоресценции становятся более размытыми и менее разграниченными на изображениях FAF.Однако самые первые морфологические изменения, наблюдаемые в FAF на краях разрыва RPE, описываемые как гиперотражающие точки различного диаметра, наблюдаются только через 3 месяца после острого события образования слезы RPE. Процессы ремоделирования в пограничной зоне, по-видимому, не обнаруживаются с помощью изображений FAF в течение первых нескольких месяцев [27]. В отличие от географической атрофии при AMD, гипофлуоресцентные области в FAF из-за образования слезы RPE не демонстрируют паттерны аномального увеличения FAF в соединительной зоне атрофии [28].

Флуоресцентная ангиография

Флуоресцентная ангиография (FLA) демонстрирует заблокированную флуоресценцию в месте свернутого РПЭ и заметную гиперфлуоресценцию в месте обнаженной сосудистой оболочки (рис. 1c) [24]. В 2010 году Sarraf et al. [24] описали тонкий дефект на краю PED с тонким кольцевым признаком гиперфлуоресценции в FLA. Это наблюдение было обнаружено в слезах РПЭ 1 степени (наибольший линейный диаметр <200 мкм) и представляет собой микроскопический дефект РПЭ, обнаруживаемый при соответствующих сканированиях оптической когерентной томографии (SD-OCT) в спектральной области.Поражения> 200 мкм ангиографически представляют собой небольшие овальные гиперфлуоресцентные дефекты на краю PED с ранним прохождением и поздним окрашиванием и тонким внутренним краем гипофлуоресцентной блокировки. Большие слезы РПЭ показывают большую серповидную область гиперфлуоресценции ранней передачи с прилегающим участком гипофлуоресцентной блокировки.

Спектрально-доменная оптическая когерентная томография

При классическом разрыве РПЭ на сканировании SD-OCT можно выделить три части участка. В первой части внешние полосы сетчатки демонстрируют нормальную архитектуру.Во второй части сетчатка образует куполообразный отрыв от сосудистой оболочки. В этой приподнятой зоне SD-OCT показывает, что свободный край волнистого сжатого РПЭ втягивается в сторону CNV. Свернутый РПЭ вызывает гиперотражение и интенсивное затенение, которое полностью маскирует сосудистую оболочку. В третьей части полностью отсутствует РПЭ, а нейросенсорная сетчатка выглядит истонченной. SD-OCT демонстрирует увеличение глубины сигнала из-за отсутствия монослоя РПЭ (рис. 1d). В некоторых случаях экссудативная реакция между нейросенсорной сетчаткой и сосудистой оболочкой может быть визуализирована при последующем наблюдении после острого события.В других случаях нейросенсорная сетчатка остается непосредственно на сосудистой оболочке [29].

Механизм образования слезы РПЭ

Развитие слезы РПЭ может происходить как спонтанный процесс или после термического лазера, фотодинамической терапии или терапии против VEGF [2,5,8,9,10,11]. В течение многих лет многие авторы постулировали механизм разрыва РПЭ, основанный на сокращении фиброваскулярных мембран [30,31,32,33]. Позже, в эпоху противодействия VEGF, увеличение частоты разрыва RPE у пациентов с AMD было интерпретировано как подтверждение установленной теории тяговых сил, вызывающих событие слезы.Сокращение мембран CNV вызывает сжатие RPE, что может вызвать повышенное натяжение на поверхности полости. Во время этого процесса на граничный RPE действуют две противоположные силы: тяговые силы от сжатия CNV и силы сцепления со стороны RPE, который все еще прикреплен. Увеличение сокращения в конечном итоге приводит к анатомической недостаточности РПЭ на стыке прикрепленного и отсоединенного РПЭ (рис. 2) [29,34].

Рис. 2

Схематический рисунок, иллюстрирующий предложенный механизм разрыва РПЭ в глазах с неоваскулярной AMD после лечения интравитреальной терапией против VEGF. a vPED содержит скрытую мембрану CNV (сине-серая), прикрепленную к нижней поверхности монослоя RPE (желто-черный клеточный слой). b Сжатие CNV вызывает растягивающие силы, которые действуют в плоскости RPE, прикладывая наибольшее механическое напряжение на стыке прикрепленного и отсоединенного RPE (звездочка). Именно в этом месте действуют две противоположные силы: сила тяги от сжатия CNV и сила сцепления со стороны RPE, которая все еще прикреплена (стрелки). c Увеличение сокращения в конечном итоге приводит к анатомической недостаточности РПЭ на стыке прикрепленного и отсоединенного РПЭ.Свободный край разорванного РПЭ отводится в сторону CNV. Цвета см. В онлайн-версии.

Мультимодальная визуализация обеспечивает понимание механизмов развития разрыва RPE на основе архитектурной конфигурации vPED до и после разрыва. Спайд [35] предположил, что скопление материала под RPE представляет собой CNV внутри PED. Контрактура этой CNV, прилегающей к нижней поверхности RPE, обеспечивает максимальное натяжение на стыке прикрепленного и отсоединенного RPE, представляющего «locus minoris resistentiae» и лежащего перпендикулярно силе сокращения CNV.Сжатый монослой РПЭ останавливается на стороне CNV, происхождение сокращения, которое становится очевидным при SD-OCT или как гиперавтофлуоресценция в FAF. В предыдущих исследованиях сообщалось о тенденции разрыва РПЭ на височной границе очага поражения ВЭД [36,37]. Причина предрасположенности этого участка к развитию слезы РПЭ остается неизвестной.

Образование слезы RPE в фиброваскулярных PED, при которых полость поражения полностью заполнена мембраной CNV, встречается реже, предположительно, поскольку силы сокращения в ответ на терапию анти-VEGF могут равномерно распространяться по всему поражению PED, обнажая монослой RPE к меньшему механическому воздействию.Напротив, при серозно-васкуляризированной PED полость PED только частично заполнена мембраной CNV [34]. Интересно, что слезы РПЭ у пациентов, получающих терапию анти-VEGF, как правило, происходят в течение 1-3 месяцев после начала интравитреального лечения, тогда как слезы РПЭ с поздним началом, как правило, возникают у пациентов, ранее не получавших лечения, или у пациентов, получавших фотодинамическую терапию [17] .

В отличие от обычного разрыва RPE, Ie et al. [38] выдвинули гипотезу о том, что механизм, ведущий к микропоршению РПЭ, основан только на гидростатических силах, вызывающих разрыв на границе РПЭ.Микрорип не следует рассматривать как предэтапный разрыв РПЭ или начало разрыва РПЭ. Гораздо более вероятно, что микрорипы и слезы RPE представляют собой две отдельные сущности, основанные на разных этиологических механизмах, как постулировали Ie et al. [38] в отличие от Sarraf et al. [39].

Прогнозирующие факторы

Поскольку разрыв РПЭ обычно приводит к разрушительной потере остроты зрения, идентификация надежных факторов риска имеет большое клиническое значение. До сих пор было описано несколько прогностических маркеров надвигающегося разрыва РПЭ, таких как высота и диаметр поражения PED, гиперотражающие линии на изображениях в ближнем инфракрасном диапазоне, небольшое отношение размера CNV к размеру PED, субретинальные щели, микротрещины и продолжительность PED. .

PED была описана как предиктор разрывов RPE Chan et al. [13]. Они сообщили о повышенной распространенности разрывов РПЭ в поражениях ПЭД размером более 400 мкм. Несколько других авторов обращались к вопросу о том, в какой точке отсечки высота PED становится фактором риска. Doguizi и Ozdek [19] статистически определили, что 580 мкм можно рассматривать как точку отсечения высоты PED для риска разрыва RPE. Аналогичным образом Sarraf et al. [39] описали рост 550 мкм как фактор высокого риска для последующего развития разрыва ППЭ, и, кроме того, Leitritz et al.[40] описали возрастающую вероятность разрывов РПЭ, особенно на высоте более 400 мкм. Более того, Chiang et al. [20] предположили, что увеличенная площадь поверхности, а также большой линейный диаметр субфовеальной PED представляют собой факторы, предрасполагающие к развитию слезы RPE (рис. 3a). Чан и др. [37] сообщили о более сильной тенденции к развитию слезы в тех поражениях PED, которые показывают меньшее отношение размера CNV к размеру PED (рис. 3b).

Рис. 3

Факторы риска разрыва РПЭ у пациентов с вПЭД, вызванной ВМД. SD-OCT изображение очага поражения vPED как большого диаметра, так и большой высоты. b Ангиографическое изображение индоцианинового зеленого, иллюстрирующее концепцию небольшого отношения CNV / PED. Гиперфлуоресценция в первую очередь представляет собой небольшой CNV, в то время как круглая гипофлуоресценция представляет большие размеры vPED, что приводит к очень маленькому соотношению. c На изображении cSLO другого очага поражения vPED в ближнем инфракрасном диапазоне видны гиперотражающие линии, исходящие от края vPED, которые распространяются по очагу поражения подобно воронке. d Комбинированный cSLO FAF и SD-OCT, отображающий небольшие гипоавтофлуоресценции на краю vPED, указывающий на области микрошипов (стрелки), которые соответствуют микроскопическим дефектам RPE (кружок), обнаруживаемым при сканировании SD-OCT справа. e Изображение SD-OCT с увеличенной глубиной изображения, показывающее субретинальную щель. Стрелка указывает на гипорефлективное пространство под неоваскулярной тканью суб-RPE.

Обнаружение сигналов повышенной отражательной способности на изображениях ближнего инфракрасного диапазона конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (cSLO) представляет собой еще один прогнозирующий маркер надвигающегося разрыва ППЭ (рис.3в). Эти гиперотражающие линии, которые обычно исходят от края поражения PED и обычно распространяются как воронка через поражение, соответствуют локализации CNV, наблюдаемой при ангиографии с индоцианином зеленым. Кроме того, гиперотражающие линии на изображениях в ближнем инфракрасном диапазоне коррелируют со складками в RPE, обнаруживаемыми в SD-OCT [34]. Эти данные указывают на механическое напряжение, вызванное сокращением CNV и расслаблением CNV.

Микрорипы РПЭ впервые были описаны как утечка на краю отслоения РПЭ с прохождением флуоресцеина в субретинальное пространство [38].Позже Sarraf et al. [24] представили систему классификации разрывов РПЭ и определили степень 1 как тонкий дефект на краю PED с тонким кольцевым признаком гиперфлуоресценции при ангиографии, а также микроскопический дефект RPE, обнаруживаемый при ОКТ. Clemens et al. [41] недавно постулировали, что микроррипы рассматриваются как фактор риска разрыва РПЭ, представляющий пациента с микрорипсом, у которого развился фовеальный разрыв РПЭ после одной инъекции анти-VEGF. Предполагается, что микрорипы снижают порог резистентности к РПЭ, и увеличение сокращения после терапии анти-VEGF может в конечном итоге привести к анатомической недостаточности РПЭ (рис.3d).

Mukai et al. [42] недавно описали образование субретинальной щели перед развитием слезы РПЭ у 3 пациентов, предположив, что эта характеристика SD-OCT является потенциальным фактором риска (рис. 3e). Эта субретинальная щель может быть результатом увеличения механического давления в суб-RPE-пространстве.

Наконец, Doguizi и Ozdek [19] сообщили об обратной зависимости между продолжительностью образования слезы PED и RPE. В их исследовании PED присутствовали в течение значительно более короткого периода в группе пациентов с разрывом RPE.Они предположили, что короткая продолжительность PED означает, что неоваскулярный процесс свежий, с незрелыми сосудами. Поскольку незрелые сосуды более восприимчивы к анти-VEGF, ответ на терапию анти-VEGF может быть более резким.

Терапия у пациентов с высоким риском

Клиницистам рекомендуется искать установленные факторы риска разрыва РПЭ до начала терапии анти-VEGF у пациентов с вПЭД, вызванной ВМД. Пациент с vPED высокого риска определяется как демонстрирующий один или несколько из описанных факторов риска разрыва RPE в начале или во время лечения анти-VEGF.Пациентам с таким высоким риском рекомендуется проводить тщательное обследование, включая SD-OCT и FAF после каждой инъекции. Если несколько факторов риска накапливаются или отдельные факторы риска значительно увеличиваются во время лечения анти-VEGF, мы предлагаем прекратить инъекционную терапию, повторно оценить поражение PED через 1-2 недели и повторить инъекцию, если появились признаки сокращения CNV. отклоняется, например, при уменьшении складок РПЭ или исчезновении гиперотражающих линий. Такой адаптированный режим может сделать терапию анти-VEGF более безопасной в отношении развития слезотечения РПЭ у пациентов с vPED из группы высокого риска.С другой стороны, откладывание терапии сопряжено с риском прогрессирования ХНВ.

Chan et al. [43] недавно сообщили о результатах проспективного исследования, сравнивающего результаты интравитреальных инъекций ранибизумаба 0,5 и 2,0 мг для лечения vPED. Более высокая доза привела к более быстрому снижению и более полному разрешению PED; однако частота разрыва RPE была выше в этой группе. Данные предполагают, что необходимо тщательно продумать величину сил сокращения на поражении PED, вызванного агентом против VEGF.Передозировка может легко привести к развитию слезы, особенно у пациентов из группы высокого риска.

Большинство доступных данных о развитии слезы РПЭ после терапии существует для бевацизумаба и ранибизумаба, в то время как для афлиберцепта имеются только отчеты об единичных случаях [11]. Рецепторные последовательности афлиберцепта обеспечивают сильное связывание с VEGF (в 140 раз больше, чем у ранибизумаба), и молекула имеет 1-месячную интравитреальную связывающую активность, которая превосходит как ранибизумаб, так и бевацизумаб. В отличие от обоих агентов против VEGF, афлиберцепт связывает не только все изомеры семейства VEGF-A, но также VEGF-B и фактор роста плаценты [44].Клиническое значение этих фармакологических различий до сих пор неизвестно. Тем не менее, можно было бы постулировать использование определенных лекарств для определенных типов PED. Предполагая более высокую эффективность CNV-сокращения афлиберцепта, может быть разумным предпочесть ранибизумаб у пациентов с vPED высокого риска и использовать aflibercept у пациентов с фиброваскулярным PED с низким риском. В одном случае описывается развитие слезы РПЭ после двух инъекций афлиберцепта у пациента с vPED, который ранее получал ранибизумаб [45].Однако в настоящее время нет дополнительных данных, касающихся этой проблемы. В настоящее время исследовательская группа набирает пациентов для проспективного изучения влияния афлиберцепта у пациентов с vPED на частоту развития слезотечения RPE. Помимо вопроса о наиболее подходящих средствах против VEGF для пациентов из группы высокого риска, еще один без ответа вопрос заключается в том, может ли определенная схема лечения быть полезной для соблюдения в отношении развития слезы в этой группе пациентов. В любом случае, особенно для глаз с высоким риском PED, пациенты должны быть проинформированы о риске развития слез во время лечения анти-VEGF.

Терапия после образования слезы

Среди клиницистов существуют разногласия относительно критериев лечения после образования слезы. Ретроспективный анализ данных трех рандомизированных многоцентровых клинических исследований фазы III ранибизумаба для лечения неоваскулярной ВМД показал, что среди пациентов, у которых был разрыв РПЭ, у пациентов, получавших ранибизумаб, как правило, наблюдалось улучшение остроты зрения [46]. Doguizi и Ozdek [19] обнаружили стабильные результаты в отношении остроты зрения у 28 пациентов, которые продолжали терапию анти-VEGF после образования разрыва RPE в течение среднего периода наблюдения 20.6 месяцев. Среднее количество инъекций анти-VEGF составило 4,1 в течение этого периода наблюдения. Окончательная острота зрения была хуже при больших разрывах РПЭ (3 ​​и 4 степени) по сравнению с более мелкими слезами (1 и 2 степени), что согласуется с выводами Sarraf et al. [24]. Сходные функциональные результаты были получены Coco et al. [47]. Об улучшении остроты зрения также сообщалось у пациентов со спонтанными слезами РПЭ, которые впоследствии получали терапию анти-VEGF [48]. Недавно Bartels et al.[49] сообщили о значительном функциональном улучшении микропериметрии и морфологии после продолжения терапии анти-VEGF в течение 3 лет из-за стойкой субретинальной и интраретинальной жидкости после образования слезы.

В настоящее время нет доступных проспективных клинических исследований; однако в настоящее время проводится интервенционное многоцентровое исследование, в котором изучается влияние фиксированных ежемесячных интравитреальных инъекций ранибизумаба на остроту зрения и морфологию сетчатки в течение 12 месяцев у 30 пациентов с разрывом ПЭС из-за неоваскулярной ВМД (ClinicalTrials.идентификатор правительства: NCT01

Тем не менее, повторная инъекция после разрыва RPE должна быть тщательно оценена, поскольку площадь разрыва RPE может значительно увеличиться при терапии анти-VEGF. Asao et al. [50] оценили эффекты дополнительной терапии анти-VEGF на 10 глазах с разрывом РПЭ после терапии анти-VEGF в течение 12 месяцев.Они наблюдали увеличение размера слезной области РПЭ> 20% в половине включенных глаз. Clemens et al. [26] сообщили о 3 пациентах, первоначально поступивших с многодолевым разрывом РПЭ, что свидетельствует о значительном увеличении разрыва РПЭ с поражением фовеальной области после еще одной инъекции анти-VEGF. С другой стороны, то же исследование показало, что однодоловые слезные дефекты РПЭ оставались стабильными в течение 6-месячного периода наблюдения. Предположительно, нити RPE между долями слезы RPE, по-видимому, предотвращают развитие слезы в многодолевых слезах.Измерение площади слезы РПЭ у этих пациентов может иметь терапевтические последствия. Если площадь разрыва РПЭ в многодолевых поражениях увеличивается, интравитреальную терапию анти-VEGF следует отложить, а повторное лечение следует рассматривать только в случае дальнейшего усиления признаков активности заболевания. Кроме того, у пациентов с небольшими участками разрыва РПЭ вне ямки и неактивными поражениями CNV тщательное наблюдение более разумно, чем быстрое повторное введение.

Mukai et al. [51] наблюдали два типа процессов восстановления после развития слезы РПЭ в небольшом визуализирующем исследовании с участием 10 пациентов.Во-первых, стойкая субретинальная жидкость после разрыва, по-видимому, приводит к последующему восстановлению утолщенной пролиферативной тканью в области потери РПЭ. Во-вторых, если достигается раннее и полное рассасывание субретинальной жидкости после развития слезы РПЭ, внешняя сетчатка оказывается непосредственно прикрепленной к мембране Бруха без прорастания пролиферативной ткани вдоль мембраны Бруха. Эти наблюдения предполагают положительное влияние на морфологию желтого пятна продолжительной терапии анти-VEGF после развития слезы RPE.Тем не менее, еще предстоит показать, приводят ли два механизма репарации к различным функциональным результатам.

Mendis и Loris [52] представили продольное исследование FAF у 14 пациентов с разрывом РПЭ и сообщили о восстановлении РПЭ области, очищенной от РПЭ, в 10 глазах и прогрессировании потери клеток РПЭ в 4 глазах. В первой группе восстановление сигнала FAF происходило центростремительно, от края области дефекта к центру, за исключением границы, где присутствовал свернутый RPE.

Предыдущие исследования показали, что базальная мембрана РПЭ более благоприятна для шлифовки РПЭ, служа каркасом, чем более глубокий коллагеновый слой мембраны Бруха, что позволяет предположить, что глубина плоскости расщепления может влиять на степень шлифовки РПЭ. . Экспериментальные исследования показали, что клетки RPE повторно заселяются от края к центру, а не из остаточных клеток, оставшихся в очищенной области [53,54].

Caramoy et al. [55] проанализировали ремоделирование ткани РПЭ в разрывах РПЭ на основе изображений FAF и SD-OCT и наблюдали доказательства восстановления поверхности в небольших разрывах РПЭ, тогда как миграция и пролиферация РПЭ могут не происходить в правой плоскости в больших разрывах.Трансплантация РПЭ с использованием эмбриональных стволовых клеток человека и индуцированных РПЭ, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, разрабатывается и оценивается как клеточно-заместительная терапия AMD. Необходимы дальнейшие исследования для оценки его способности восстанавливать часть утраченной функции РПЭ у пациентов, страдающих разрывом РПЭ [56].

Выводы

Из-за растущего числа интравитреальных инъекций анти-VEGF пациентам с AMD частота образования слезотечения RPE увеличилась. Таким образом, клиницисты должны знать стратегии предотвращения развития слезы РПЭ во время терапии анти-VEGF и лечения пациентов после образования слезы РПЭ.Адаптированная схема лечения vPED высокого риска может предотвратить развитие слезы у пациентов. После образования слезы РПЭ рекомендуется лечение анти-VEGF до тех пор, пока присутствуют признаки активности. Мультимодальная визуализация во время терапии анти-VEGF у пациентов с высоким риском представляет собой ключевой инструмент для выявления факторов риска и повышения безопасности антиангиогенного лечения. В будущих исследованиях необходимо рассмотреть несколько вопросов, например, какой агент против VEGF наиболее подходит для пациентов с vPED с высоким риском, какая схема лечения наиболее эффективна после развития слезы RPE и насколько можно улучшить визуализацию сетчатки для визуализации факторов риска слезы RPE. как можно раньше и для выявления новых характеристик, указывающих на надвигающийся разрыв РПЭ.

Заявление о раскрытии информации

C.R. Clemens связан с Heidelberg Engineering, Novartis и Bayer; Н. Этер связана с Heidelberg Engineering, Novartis, Bayer, Sanofi Aventis, Allergan и Bausch and Lomb.

Список литературы

1. Casswell AG, Kohen D, Bird AC: Отслоения пигментного эпителия сетчатки у пожилых людей: классификация и исход.Br J Ophthalmol 1985; 69: 397-403.
2. Йео Дж. Х., Маркус С., Мерфи Р. П.: Пигментные эпителиальные разрывы сетчатки. Закономерности и прогноз. Офтальмология 1988; 95: 8-13.
3. Pauleikhoff D, Löffert D, Spital G, Radermacher M, Dohrmann J, Lommatzsch A, Bird AC: Отслоение пигментного эпителия у пожилых людей.Клиническая дифференциация, естественное течение и патогенетические последствия. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2002; 240: 533-538.
4. Хоскин А., Берд А.С., Сехми К. Слезы отслоившегося пигментного эпителия сетчатки. Br J Ophthalmol 1981; 65: 417-422.
5. Гелискен Ф., Инхоффен В., Партш М., Шнайдер У., Крайссиг I. Разрыв пигментного эпителия сетчатки после фотодинамической терапии хориоидальной неоваскуляризации.Am J Ophthalmol 2001; 131: 518-520.
6. Гасс Дж. Д.: Разрыв пигментного эпителия сетчатки во время лазерной фотокоагуляции криптоновым красным. Am J Ophthalmol 1984; 98: 700-706.
7. Томпсон Дж. Т.: Разрыв пигментного эпителия сетчатки после транспупиллярной термотерапии по поводу неоваскуляризации хориоидеи.Am J Ophthalmol 2001; 131: 662-664.
8. Сингх Р.П., Сирс Дж. Э.: Разрывы пигментного эпителия сетчатки после инъекции пегаптаниба при экссудативной возрастной дегенерации желтого пятна. Am J Ophthalmol 2006; 142: 160-162.
9. Shah CP, Hsu J, Garg SJ, Fischer DH, Kaiser R: Разрыв пигментного эпителия сетчатки после интравитреальной инъекции бевацизумаба.Am J Ophthalmol 2006; 142: 1070-1072.
10. Carvounis PE, Kopel AC, Benz MS: разрывы пигментного эпителия сетчатки после ранибизумаба по поводу экссудативной возрастной дегенерации желтого пятна. Am J Ophthalmol 2007; 143: 504-505.
11. Сайто М., Кано М., Итагаки К., Огучи Ю., Секирю Т.: Разрыв пигментного эпителия сетчатки после интравитреальной инъекции афлиберцепта.Clin Ophthalmol 2013; 7: 1287-1289.
12. Meyer CH, Mennel S, Schmidt JC, Kroll P: Острый разрыв эпителиального пигмента сетчатки после интравитреальной инъекции бевацизумаба (Авастина) для скрытой хориоидальной неоваскуляризации, вторичной по отношению к возрастной дегенерации желтого пятна. Br J Ophthalmol 2006; 90: 1207-1208.
13. Chan CK, Abraham P, Meyer CH, Kokame GT, Kaiser PK, Rauser ME, Gross JG, Nuthi AS, Lin SG, Daher NS: высота отслоения пигментного эпителия, измеренная с помощью оптической когерентной томографии, как предиктор разрыва пигментного эпителия сетчатки, связанных с интравитреальным бевацизумаб для инъекций.Retina 2010; 30: 203-211.
14. Чанг Л.К., Флаксел С.Дж., Лауэр А.К., Сарраф Д.: слезы РПЭ после лечения пегаптанибом при возрастной дегенерации желтого пятна. Retina 2007; 27: 857-863.
15. Клеменс С.Р., Вольф А., Альтен Ф, Милойчич С., Этер Н.: Ежемесячное лечение ранибизумабом при отслойке пигментного эпителия сосудов из-за возрастной дегенерации желтого пятна.ARVO 2015; Плакат 2838 — C0066.
16. Сарраф Д., Чан С., Рахими Е., Абрахам П.: Проспективная оценка частоты и факторов риска развития слезотечения РПЭ после терапии высокими и низкими дозами ранибизумаба. Retina 2013; 33: 1551-1557.
17. Губер Дж., Правин А., Саид М.Ю.: Более высокая частота разрывов пигментного эпителия сетчатки после ранибизумаба при неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна с увеличением высоты отслоения пигментного эпителия.Br J Ophthalmol 2013; 97: 1486-1487.
18. Smith BT, Kraus CL, Apte RS: Пигментные эпителиальные разрывы сетчатки в глазах, обработанных ранибизумабом. Retina 2009; 29: 335-339.
19. Doguizi S, Ozdek S: Разрывы пигментного эпителия, связанные с терапией анти-VEGF: частота, долгосрочные визуальные результаты и связь с отслоением пигментного эпителия при возрастной дегенерации желтого пятна.Сетчатка 2014; 34: 1156-1162.
20. Chiang A, Chang LK, Yu F, Sarraf D: Предикторы анти-VEGF-ассоциированного разрыва пигментного эпителия сетчатки с использованием анализа FA и OCT. Сетчатка 2008; 28: 1265-1269.
21. Wong LJ, Desai RU, Jain A и др.: Наблюдение за потенциальными побочными эффектами, связанными с использованием интравитреального бевацизумаба при заболеваниях сетчатки и сосудов сосудистой оболочки глаза.Retina 2008; 28: 1151-1158.
22. Wolf A, Rüping J, Neubauer AS, Mayer W, Ulbig M, Haritoglou C, Holz FG, Eter N, Kampik A: Изменения отслоения пигментного эпителия сосудов, связанные с возрастной дегенерацией желтого пятна во время загрузки интравитреальным ранибизумабом. Сетчатка 2013; 33: 1843-1849.
23. Mennel S, Callizo J, Schmidt JC, Meyer CH: Острый разрыв пигментного эпителия сетчатки в необработанном парном глазу после повторных инъекций бевацизумаба (Авастина). Acta Ophthalmol Scand 2007; 85: 689-691.
24. Sarraf D, Reddy S, Chiang A, Yu F, Jain A: Новая система оценки пигментных эпителиальных слез сетчатки.Retina 2010; 30: 1039-1045.
25. фон Рюкманн А., Фитцке Ф. В., Берд А. С.: Распределение аутофлуоресценции глазного дна с помощью сканирующего лазерного офтальмоскопа. Br J Ophthalmol 1995; 79: 407-412.
26. Клеменс С.Р., Альтен Ф., Баумгарт С., Хейдушка П., Этер Н.: Количественная оценка площади разрыва пигментного эпителия сетчатки при возрастной дегенерации желтого пятна.Сетчатка 2014; 34: 24-31.
27. Карамой А., Фаузер С., Кирххоф Б. Результаты автофлуоресценции глазного дна и оптической когерентной томографии в спектральной области, предполагающие ремоделирование ткани в разрыве пигментного эпителия сетчатки. Br J Ophthalmol 2010; 96: 1211-1216.
28. Bindewald A, Schmitz-Valckenberg S, Jorzik JJ, Dolar-Szczasny J, Sieber H, Keilhauer C, Weinberger AW, Dithmar S, Pauleikhoff D, Mansmann U, Wolf S, Holz FG: Классификация паттернов аномальной аутофлуоресценции глазного дна в зоне соединения географической атрофии у пациентов с возрастной дегенерацией желтого пятна.Br J Ophthalmol 2005; 89: 874-878.
29. Nagiel A, Freund KB, Spaide RF, Munch IC, Larsen M, Sarraf D: Механизм образования слезы пигментного эпителия сетчатки после интравитреальной терапии антиваскулярным фактором роста эндотелия, выявленный с помощью оптической когерентной томографии в спектральной области.Am J Ophthalmol 2013; 156: 981-988.
30. Чуанг Е.Л., Берд А.С.: Патогенез разрыва пигментного эпителия сетчатки. Am J Ophthalmol 1988; 105: 285-290.
31. Gass JDM: Патогенез разрыва пигментного эпителия сетчатки.Br J Ophthalmol 1984; 68: 513-519.
32. Toth CA, Pasquale AC III, Graichen DF: Клинико-патологическая корреляция спонтанных разрывов пигментного эпителия сетчатки с хориоидальными неоваскулярными мембранами при возрастной дегенерации желтого пятна. Офтальмология 1995; 102: 272-277.
33. Lafaut BA, Aisenbrey S, Vanden Broecke C, Krott R, Jonescu-Cuypers CP, Reynders S, Bartz-Schmidt KU: Клинико-патологическая корреляция разрыва пигментного эпителия сетчатки при экссудативной возрастной дегенерации желтого пятна: предразрывы, слезы и рубцы.Br J Ophthalmol 2001; 85: 454-460.
34. Клеменс CR, Bastian N, Alten F, Milojcic C, Heiduschka P, Eter N: Прогнозирование разрыва пигментного эпителия сетчатки при отслоении серозного васкуляризированного пигментного эпителия. Acta Ophthalmol 2014; 92: 50-56.
35. Spaide RF: Оптическая когерентная томография с улучшенной глубинной визуализацией отслоения пигментного эпителия сетчатки при возрастной дегенерации желтого пятна.Am J Ophthalmol 2009; 147: 644-652.
36. Decker WL, Sanborn GE, Ridley M, Annesley WH Jr, Sorr EM: разрывы пигментного эпителия сетчатки. Офтальмология 1983; 90: 507-512.
37. Чан С.К., Мейер С.Х., Гросс Дж.Г., Абрахам П., Нути А.С., Кокаме Г.Т., Лин С.Г., Раузер М.Э., Кайзер П.К .: Разрывы пигментного эпителия сетчатки после интравитреальной инъекции бевацизумаба при неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна.Retina 2007; 27: 541-551.
38. Т.е. Д., Яннуцци Л.А., Спайде Р.Ф., Вудворд К.П., Зингерман Л.Дж., Блюменкранц М.С.: Микрорипы пигментного эпителия сетчатки. Arch Ophthalmol 1992; 110: 1443-1449.
39. Сарраф Д., Чан С., Рахими Е., Абрахам П.: Проспективная оценка частоты и факторов риска развития слезотечения РПЭ после терапии высокими и низкими дозами ранибизумаба.Retina 2013; 33: 1551-1557.
40. Leitritz M, Gelisken F, Inhoffen W, Voelker M, Ziemssen F: Можно ли предсказать риск разрыва пигментного эпителия сетчатки после лечения бевацизумабом? Исследование оптической когерентной томографии. Глаз 2008; 22: 1504-1507.
41. Клеменс Ч.Р., Альтен Ф., Этер Н .: Чтение знаков: микрорипы как прогностический признак надвигающегося развития слезы РПЭ.Acta Ophthalmol 2015, Epub опережает печать.
42. Мукаи Р., Сато Т., Киши С.: предшествующая стадия разрыва пигментного эпителия сетчатки при возрастной дегенерации желтого пятна. Acta Ophthalmol 2014; 92: 407-408.
43. Чан С.К., Абрахам П., Сарраф Д., Нути А.С., Лин С.Г., Макканнел Калифорния: более ранние терапевтические эффекты, связанные с высокими дозами (2.0 мг) ранибизумаб для лечения отслоения васкуляризированного пигментного эпителия при возрастной дегенерации желтого пятна. Глаз 2015; 29: 80-87.
44. Стюарт М.В., Розенфельд П.Дж .: Прогнозируемая биологическая активность интравитреальной ловушки VEGF. Br J Ophthalmol 2008; 92: 667-668.
45. Бертельманн Т., Секундо В., Веннер Ю.: Разрыв пигментного эпителия сетчатки путем интравитреальной инъекции афлиберцепта.Офтальмолог 2014; 111: 775-777.
46. Cunningham ET Jr, Feiner L, Chung C, Tuomi L, Ehrlich JS: Частота разрыва пигментного эпителия сетчатки после интравитреальной инъекции ранибизумаба при неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна. Офтальмология 2011; 118: 2447-2452.
47. Коко Р.М., Санабрия М.Р., Эрнандес А.Г., Фернандес Муньос М: Разрывы пигментного эпителия сетчатки при возрастной дегенерации желтого пятна, леченные антиангиогенными препаратами: контролируемое исследование с длительным периодом наблюдения.Офтальмология 2012; 228: 78-83.
48. Lesniak SP, Fine HF, Prenner JL, Roth DB: Долгосрочное наблюдение за спонтанными разрывами пигментного эпителия сетчатки при возрастной дегенерации желтого пятна, леченных терапией против VEGF. Eur J Ophthalmol 2011; 21: 73-76.
49. Bartels S, Barrelmann A, Book B, Heimes B, Gutfleisch M, Spital G, Pauleikhoff D, Lommatzsch A: Разрыв пигментного эпителия сетчатки при терапии анти-VEGF экссудативной возрастной макулярной дегенерации: восстановление функции при интенсивной терапии.Офтальмолог 2014; 111: 460-464.
50. Асао К., Гоми Ф., Сава М., Нисида К. Дополнительная терапия противоваскулярным фактором роста эндотелия для глаз с разрывами пигментного эпителия сетчатки после начальной терапии. Retina 2014; 34: 512-518.
51. Мукаи Р., Сато Т., Киши С.: Механизм восстановления разрыва пигментного эпителия сетчатки при возрастной дегенерации желтого пятна.Retina 2015; 35: 473-480.
52. Mendis R, Lois N: Автофлуоресценция глазного дна у пациентов с разрывами пигментного эпителия сетчатки (RPE): оценка шлифовки RPE in-vivo. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2014; 252: 1059-1063.
53. Леонард Д.С., Чжан XG, Паноццо Г., Сугино И.К., Зарбин М.А.: Клинико-патологическая корреляция локальной санации пигментного эпителия сетчатки.Инвестируйте офтальмол Vis Sci 1997; 38: 1094-1109.
54. Del Priore LV, Kuo YH, Tezel TH: Возрастные изменения плотности клеток РПЭ человека и пропорции апоптоза in situ. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 2002; 43: 3312-3318.
55. Карамой А., Кирххоф Б., Фаузер С. Морфологическая и функциональная жизнеспособность фоторецепторов в слезах пигментного эпителия сетчатки.Acta Ophthalmol 2012; 90: 328-329.
56. Stanzel BV, Liu Z, Somboonthanakij S, Wongsawad W, Brinken R, Eter N, Corneo B, Holz FG, Temple S, Stern JH, Blenkinsop TA: стволовые клетки РПЭ человека, выращенные в поляризованные монослои РПЭ на полиэфирной матрице, сохраняются после трансплантации в субретинальное пространство кролика.Отчеты о стволовых клетках 2014; 2: 64-77.

Автор Контакты

Christoph R. Clemens, MD

Отделение офтальмологии, Медицинский центр Университета Мюнстера

Domagkstrasse 15

DE-48149 Münster (Германия)

Электронная почта [email protected]

Подробности статьи / публикации

Предварительный просмотр первой страницы

Получено: 21 апреля 2015 г.
Принято: 12 августа 2015 г.
Опубликовано в Интернете: 22 октября 2015 г.
Дата выпуска: январь 2016 г.

Количество страниц для печати: 9
Количество рисунков: 3
Количество столов: 0

ISSN: 0030-3755 (печатный)
eISSN: 1423-0267 (онлайн)

Для дополнительной информации: https: // www.karger.com/OPH

Авторские права / Дозировка препарата / Заявление об ограничении ответственности

Авторские права: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование или с помощью какой-либо системы хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
Дозировка лекарств: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарств, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Однако ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю настоятельно рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новый и / или редко применяемый препарат.
Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор (-ы) не несут ответственности за любой ущерб, причиненный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте или рекламе.

Трансплантация пигментного эпителия сетчатки и фоторецепторов, образующихся одновременно с помощью низкомолекулярной дифференцировки, восстанавливает зрительную функцию в моделях дегенерации сетчатки на грызунах | Исследования и терапия стволовыми клетками

Обработка EB небольшими молекулами способствует индукции глазного поля

Используемый здесь процесс дифференциации требует последовательного добавления факторов роста и коктейлей малых молекул, что приводит к трем основным этапам, которые повторяют развитие сетчатки in vivo (рис.1) для получения РПЭ и ПРП.

Схематическая диаграмма показывает, как наша унифицированная дифференцировка моделирует in vivo вехи развития сетчатки человека — начиная от недифференцированных ИПСК до образования зрелых клеток RPE и PRP.

Культуры ИПСК поддерживались в виде колоний (Рис. 2a ). Культуры ИПСК были> 95% положительными по OCT4 (рис. 2b) до начала дифференцировки. Во время размножения, после воздействия DIM и посева EB, клетки формируют структуры, похожие на розетки, окруженные островками эпителиальной популяции и некоторыми поддерживающими клетками (рис.2в).

Индукция ИПСК к предшественникам сетчатки и их характеристика. a TC-1133 hiPSC колония. b hiPSC, экспрессирующий более 95% OCT4. c Формирование эмбриоидных телец из ИПСК и их индукция в предшественниках сетчатки. d — g Иммунофлуоресцентные изображения, представляющие экспрессию белка на 20 день до отбора. d Нейроэктодермальные маркеры PAX6, Nestin, SOX1 и SOX2. e Маркеры приверженности сетчатки RX, LHX2, CRX и OTX2. f Нейронные маркеры FOXG1 и GFAPΔ. г Экспрессия OCT4 и Ki67. ч Количественная оценка гена с использованием ПЦР в реальном времени выбранных маркеров в предшественниках сетчатки на 20-е сутки и предшественниках РПЭ и предшественниках фоторецепторов после розеточного отбора, представленная как кратное изменение по отношению к недифференцированным ИПСК. Изображения и графики представляют как минимум три независимых эксперимента. Масштабные линейки представляют 100 мкм.

Нейроэктодермальный клон индуцировали с использованием стандартного двойного ингибирования SMAD и добавления IGF1.Успешная индукция была подтверждена на основании присутствия нейроэктодермальных маркеров, PAX6, Nestin, SOX2 и SOX1 (рис. 2d), и маркеров ранней спецификации сетчатки, RX, LHX2, CRX и OTX2 (рис. 2e). Маркеры пролиферирующих нейральных предшественников FOXG1 и GFAPΔ также экспрессировались на 20 день (фиг. 2f). Хотя экспрессия OCT4 упала до <15%, существует значительная популяция клеток, положительных по маркеру пролиферации Ki67 на стадии экспансии (рис. 2g), как и ожидалось.

На стадии зрительного пузыря как дистальный, так и проксимальный домены являются «бипотенциальными» и способны давать начало нейроретинам или RPE [16].Под влиянием вышележащей поверхностной эктодермы проксимальный домен приобретает идентичность RPE, а дистальный домен развивается в нейроретину. Количественное профилирование генов бипотенциальных предшественников сетчатки и разделенных предшественников RPE и PRP выявило различия в паттернах экспрессии генов. Массив генов-предшественников сетчатки состоял из генов ранней нейроэктодермы и нейроретины с детектируемой экспрессией со стадии предшественников на 20 день (рис. 2h). Наблюдалась значительная активация генов, необходимых для детерминации судьбы RPE и PRP, которая была исключительной для негорозеточной и розеточной фракций, соответственно (рис.2ч). Эти данные профилирования генов подтверждают как успешную индукцию глазного поля, так и эффективность нашего процесса захвата розетки в получении желаемых типов клеток сетчатки.

Привязка клеток зрительного пузыря к RPE

Выбранная фракция без розетки постепенно переводилась на RMM. Клетки выращивали в 5% сыворотке до тех пор, пока они не начали пигментировать, и после этого поддерживали в среде 2% сыворотки (фиг. 3a). Пигментация началась на 35-40 день и продолжала увеличиваться как по интенсивности, так и по количеству пигментирующих колоний, при этом коричнево-черная пигментация в конечном итоге была видна невооруженным глазом (рис.3б, в). Предшественники RPE экспрессировали цитоплазматический маркер Ezrin и ретинальный гомеобоксный фактор транскрипции RX на 35 день (фиг. 3d). Как и ожидалось, нейроретина-маркеры PAX6, нестин и CRX (рисунок S1A) и маркеры нервных стволовых клеток SOX2 и GFAPΔ снизились на 35 день по сравнению с предшественниками сетчатки на 20 день (рисунок S1B). Сильная экспрессия белка плотных контактов ZO1 (рис. 3e) и картина окрашивания подтверждают типичную гексагональную морфологию клеток RPE по достижении ими 70-го дня. Фактор транскрипции, связанный с микрофтальмией, MITF (рис.3f) был обнаружен уже на 25-й день и продолжал экспрессироваться на протяжении всей дифференцировки RPE. Экспрессия OTX2, которая была обнаружена на 35 день, ограничивалась только пигментирующими колониями на 50 день (фиг. 3f). Белок зрительного цикла RPE65 появился на 50-й день и изменился на отчетливые гранулярные отложения на 70-й день (фиг. 3g). Белок премеланосомы PMEL17 и ограничивающий скорость фермент биосинтеза меланина, тирозиназа, были обнаружены в полностью пигментированных областях культур RPE (рис. 3g). Локализация β-катенина варьировала от 50 до 70 дня, что указывает на изменение статуса пути Wnt (рис.3ч). Начало ресничек, которое, как сообщается, сопутствует инактивации пути Wnt [17], подтверждается присутствием маркеров ресничек ARL13B и ацетилированного тубулина в клетках RPE (Fig. 3h). Эти клетки также экспрессировали высокие уровни нитчатого актина, о чем свидетельствует окрашивание фаллоидином (рис. 3h).

Дифференциация и характеристика пигментного эпителия сетчатки (РПЭ). a — c Светлопольные изображения в процессе дифференциации. a Популяция эпителия начинает проявлять пигментацию и типичную гексагональную морфологию. b Планшеты для культивирования RPE, показывающие возрастающие уровни видимой пигментации в прогрессивные дневные точки. c Морфология пигментирующих культур РПЭ в разные дневные точки. d — h Иммунофлуоресцентные изображения, представляющие экспрессию белка на разных стадиях дифференцировки RPE. d маркеров предшественников RPE Ezrin и RX на 35 день. e Белок плотного соединения ZO1 на 35-й и 70-й день. f Фактор приверженности RPE MITF на 35-й и 70-й день; Фактор поддержания РПЭ ОТХ2 на 35-й и 50-й день. г Зрелые маркеры РПЭ RPE65 на 50-й и 70-й день и PMEL17 и тирозиназа на 70-й день. ч Маркеры ресничек РПЭ β-катенин на 50-й и 70-й день и фаллоидин, ARL13B и ацетилированный тубулин на 70-е сутки. i Профиль количественной оценки гена с использованием ПЦР в реальном времени выбранных маркеров, представленных как кратное изменение 40-, 50- и 70-дневного RPE по отношению к недифференцированному iPSC. j Анализ проточной цитометрии MITF, RPE65, PMEL17, FOXG1 и Ki67 в день 70 RPE. Изображения и графики представляют как минимум три независимых эксперимента. Масштабные полосы представляют 100 мкм.

RPE, была установлена ​​на разных этапах (40, 50 и 70 дни) с помощью количественной ПЦР (qPCR) (фиг. 3i). Было обнаружено, что экспрессия OCT4, , SOX2, и THRβ полностью подавлена; Экспрессия генов, связанных с пигментацией, таких как DCT и SIX3 , постепенно увеличивалась с течением времени.Маркеры RPE MITF , ZO1 , RPE65 и Тирозиназа показали последовательную экспрессию, тогда как экспрессия маркеров предшественника и PRP снизилась. Данные секвенирования мРНК для того же набора генов, представленные в виде тепловых карт, подтвердили результаты КПЦР (рисунок S1E). Процент клеток, экспрессирующих специфичные для RPE маркеры, дополнительно анализировали с помощью проточной цитометрии. Более 70% клеток экспрессировали MITF и RPE65 и около 30% клеток экспрессировали PMEL17 (рис.3j). Учитывая, что клетки сетчатки происходят из нейроэктодермы, мы ожидали присутствия некоторых нервных клеток в наших культурах ранней стадии RPE, и около 30% клеток были положительными по FOXG1 (Fig. 3j). На этот день 70 клетки FOXG1 не были пролиферативными, поскольку они не были положительными по Ki67. Однако подмножество MITF-положительных клеток было положительным по Ki67 (фиг. S1D), что указывает на пролиферирующие клетки RPE. Не было контаминирующих плюрипотентных клеток в популяции RPE, о чем свидетельствует полное подавление OCT4 с помощью кПЦР (рис.3i) и иммуноокрашивание (Рисунок S1C). Обогащение кластера генов, связанных с зрительным циклом, пигментацией и факторами адгезии клеток плотного соединения в RPE, было очевидно из данных кПЦР и секвенирования (рис. 3i и 5i). Значительная повышающая регуляция генов RPE взрослого и плода в зрелых предшественниках RPE и RPE, соответственно (рис. S5D, E), окончательно подтверждает специфическую для RPE сигнатуру этих клеток. Кроме того, гены нейроэктодермы со временем подавлялись вместе с полным подавлением генов ганглиев сетчатки в RPE (рис.5ч; Рисунок S1A, B).

RPE тесно взаимодействует с иммунными клетками через множество секреторных сигнальных молекул, выполняющих различные физиологические роли. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) секретируется в ответ на окислительный стресс из-за накопления конечных продуктов гликирования в мембране Бруха и играет роль в ангиогенезе [18]. Фактор роста пигментного эпителия (PEDF) защищает нейроны от апоптоза и стабилизирует хориокапилляры, действуя как антиангиогенный фактор в пролиферирующих эндотелиальных клетках [18].Уровни VEGF и PEDF, секретируемых из наших культур RPE, анализировали с iPSC и ARPE-19 в качестве отрицательного и положительного контролей, соответственно. И живые, и криоконсервированные клетки RPE в конечный день секретировали значительно большее количество VEGF и PEDF, чем ARPE-19 (фиг. 6a). Хотя никаких дополнительных этапов обогащения не применялось, однозначное присутствие ключевых маркеров и секреции VEGF и PEDF подтверждает устойчивое образование RPE de novo. Следовательно, культуры RPE на 70-е сутки, которые использовали для исследований in vivo, в основном включали клетки, экспрессирующие RPE-специфические сигнатуры с некоторыми поддерживающими клетками ретинального клона.

Получение PRP посредством спецификации нейроретины

Плотно упакованные розетки, появившиеся после воздействия DPM, были отобраны во время сбора розетки и повторно посажены. Фракция, обогащенная розетками, поддерживалась в DPM для индукции образования нейроретины, которая в конечном итоге приводит к возникновению PRP (фиг. 4a). Примерно на 50 день наблюдали клетки с дендритными выступами, которые считались связанными друг с другом PRP. Эти PRP при дальнейшем созревании превращаются в фоторецепторы, включая палочки и колбочки.Во время дифференцировки была отмечена плотная и сложная сеть между клетками (рис. 4b). Экспрессия PAX6, RX и LHX2, наблюдаемая на 20 день, оставалась неизменной на протяжении всей дифференцировки (фиг. 4c). Экспрессия OTX2 наблюдалась на 30 день и показывала однородную экспрессию до последней стадии, в отличие от RPE (рис. 4d). Экспрессия фактора транскрипции гомеобокса колбочек-палочек, CRX, который важен для дифференцировки фоторецепторов [19], наблюдалась с 35 по 70 день (рис. 4d). И MITF, и ZO1 показали слабую экспрессию на 35-й день, в то время как ZO1 начал исчезать после 50-го дня (рисунок S2A).На 35 день подмножество клеток было положительным по SOX1, нестину и GFAPΔ; FOXG1 был обнаружен в большинстве клеток (рисунок S2B). К 70 дню экспрессия FOXG1 была обнаружена только в 30% клеток, но не было экспрессии GFAPΔ (данные не показаны).

Размножение и характеристика предшественников фоторецепторов (PRP). a , b Светлопольные изображения в процессе дифференциации. — популяция розеток, отобранная для размножения нейроретинальных клеток. b Образование контактных синапсов в фоторецепторах. c — g Иммунофлуоресцентные изображения, представляющие экспрессию белка на стадиях дифференцировки PRP. c Маркеры предшественников фоторецепторов PAX6, RX и LHX2 на 35 день. d Факторы фиксации фоторецепторов OTX2 и CRX на 35 и 70 дни. e Маркер ганглиев сетчатки BRN3A на 35 день. f Маркеры конических клеток THRβ на на 50-й и 70-й дни и визуальный арест на 70-й день. г Маркеры стержневых клеток Recoverin и Rhodopsin на 50 и 70 дни и NRL2 на 70 день. h Профиль количественной оценки генов с использованием ПЦР в реальном времени выбранных маркеров, представленных как кратное изменение в 35-, 60-, 75-дневном RPE с в отношении недифференцированных ИПСК. i Анализ проточной цитометрии на CRX, OTX2, THRβ, родопсин и Ki67 на 70-й день PRP. Изображения и графики представляют как минимум три независимых эксперимента. Масштабные линейки представляют 100 мкм

Обычно культуры нейроретина также состоят из ганглиозных клеток, а также клеток колбочек и палочек.Как и ожидалось, маркер ганглия сетчатки BRN3A начал коэкспрессию с OTX2 на 35 день (фиг. 4e). Экспрессия маркера колбочек THRβ была обнаружена с 50-го дня, а на 70-й день он совместно экспрессировался с зрительным аррестином, который играет критическую роль в качестве молекулярного переключателя в палочковидных и колбочковых клетках во время фототрансдукции (рис. 4f). Рековерин — это кальций-связывающий белок сетчатки, который действует выше родопсина, регулируя его фосфорилирование. Оба белка экспрессируются сравнительно с рековерином, демонстрируя более интенсивную картину окрашивания (рис.4г). Кроме того, экспрессия обоих белков была ограничена отдельными аксоноподобными выступами на 70 день (фиг. 4g). Фактор транскрипции NRL, который важен для спецификации стержневых клеток, взаимодействует с CRX, чтобы регулировать транскрипцию родопсина и контролировать выживание фоторецепторов [20]. Как и ожидалось, NRL появился вместе с Recoverin в наших 70 культурах (рис. 4g). Экспрессия OCT4 была минимальной или отсутствовала, в то время как низкий уровень Ki67 наблюдался в наших клетках PRP (фиг. 3i, фиг. S2C).

PRP-специфического гена проверяли на разных этапах (35, 60 и 75 дни) с помощью кПЦР (рис.4ч). CHX10 , PAX6 , LHX2 и RX были значительно активированы вместе с BRN3A , OTX2 , Recoverin и THRβ . Как и предполагалось, уровни MITF и тирозиназы были значительно подавлены. Мы также заметили полное подавление OCT4 и ZO1 с минимальной экспрессией SOX2 на 75 день (рис. 3h). Кроме того, анализ проточной цитометрии подтвердил, что> 80% клеток были положительными по ключевым белкам PRP, включая CRX, OTX2 и THRβ (рис.4i). Профили маркеров были подтверждены с использованием данных секвенирования мРНК, которые также показали повышенную регуляцию генов нейроретина (фиг. 5j; фигуры S1E, S2D). К 50 дню наши культуры PRP почти полностью состояли из клеток нейроретины, что было подтверждено профилированием экспрессии ключевых маркеров PRP. Кроме того, KCl-индуцированная деполяризация наблюдалась с PRP на 55-й день (фигура S2E), и клетки на 55-й и 75-й день использовали для исследований трансплантации.

Анализ и интерпретация данных RNAseq. a Блок-схема рабочего процесса RNAseq и биоинформатического анализа. b Круговая диаграмма, показывающая распределение генов, взятых в образцах, категории, дополнительно поясняемые кольцевой диаграммой. c Иерархическая кластеризация выборок с использованием метода UPGMA. d Анализ главных компонентов, показывающий взаимосвязь между активными переменными. e Пять типовых диаграмм Венна дифференциально экспрессируемых генов из предшественников сетчатки, RPE и PRP; значительно экспрессируются гены пути и сигнальные молекулы. f Столбчатый график, показывающий регуляцию различных путей в образцах ИПСК, РПЭ и PRP. г Онтология гена и анализ кратного обогащения для RPE и PRP. h — j Тепловая карта показывает кластеризацию и дифференциальную экспрессию ключевых генов из данных RNAseq в ИПСК, предшественниках сетчатки на 20-е сутки и RPE и PRP на 70-е сутки. ч Предшественники сетчатки. i сигнатурных генов RPE. j Гены PRP, специфичные для палочек и колбочек. Цвета тепловой карты: от красного к зеленому через черный

Молекулярная сигнатура RPE и PRP, полученных из ИПСК

Мы создали глобальные профили экспрессии РНК клеток на разных стадиях дифференцировки сетчатки и сравнили их с профилями ИПСК.Данные были проверены на качество, и средний балл Phred по базовому качеству составил более 38,8 с выравниванием чтения> 97% (рисунок S4A). Нежелательные последовательности удаляли, и считывания парных концов выравнивали с эталонным геномом человека GRCh47 / hg19 из базы данных UCSC (фиг. 5a). Мы разделили типы генов на кодирующие / некодирующие гены и затем обнаружили, что 37% популяции являются генами, кодирующими белок (рис. 5b). Иерархический кластерный анализ и анализ главных компонентов (PCA) были выполнены для оценки сходства или различий в паттернах экспрессии генов среди образцов на различных стадиях дифференциации.Предшественники RPE и сетчатки были сгруппированы вместе, а все другие образцы были сгруппированы отдельно (рис. 5c). Как и ожидалось, комбинированная дисперсия 93% (F1 против F2) указывает на то, что профили экспрессии генов RPE и PRP находятся на разумном расстоянии от исходной популяции iPSC. Дисперсия в выборках увеличивалась с прогрессом дифференциации (рис. 5d).

Нормализованное количество считываний было создано с помощью преобразования журнала и представлено как кратное изменение по сравнению с iPSC.Было обнаружено, что эти логарифмические (кратное изменение) значения имеют нормальное распределение (данные не показаны). Те гены, которые оказались на 2 стандартных отклонения от среднего значения, считались статистически значимыми. Затем мы проанализировали перекрытие генов предшественников сетчатки, RPE и PRP и обнаружили, что большинство генов не перекрываются, что указывает на профили экспрессии, специфичные для клеток (рис. 5e, рис. S4E). Группирование генов нейроретина показало сильную экспрессию в предшественниках сетчатки и PRP, тогда как только очень низкую экспрессию в клетках RPE (рис.5h – j). Точно так же перекрытие сигнальных молекул и путей в трех популяциях было минимальным (рис. 5f, рис. S4C, D, S5F). Сравнение путей, вовлеченных в iPSCs, RPE и PRPs, подтвердило дифференциальную регуляцию. Примечательно, что путь передачи сигналов кальция был значительно активирован в PRP (фиг. 5f). Обогащенный анализ Gene Ontology (GO) был выполнен с использованием GO Consortium. Активированные гены предшественников сетчатки, RPE и PRP относятся к путям, связанным с развитием и функцией глаза, которые идентифицированы как складчатое обогащение (рис.5g, S4B).

Гены, связанные с развитием центральной нервной системы, были обнаружены в предшественниках сетчатки, но в значительной степени были выключены на более поздних стадиях дифференцировки. Аналогичная тенденция наблюдалась для маркеров других зародышевых листков (Рисунок S5B, C). Это углубленное профилирование экспрессии RPE и PRP подтвердило используемую здесь стратегию дифференциации, а также была подтверждена воспроизводимость этого метода в других линиях PSC, включая одну из наших собственных линий iPSC (Рисунок S3).

Трансплантация RPE задержала потерю остроты зрения у крыс RCS

После подтверждения молекулярных сигнатур de novo-генерируемых RPE и PRP мы приступили к тестированию их эффективности на моделях грызунов. Для трансплантации RPE мы использовали крыс RCS с рецессивно наследуемой мутацией в гене MERTK , который кодирует рецепторную тирозинкиназу. Эта мутация предотвращает фагоцитоз внешних сегментов фоторецепторов с помощью RPE, что приводит к дегенерации сетчатки. Крысы RCS являются обычно используемой моделью для исследований трансплантации RPE.Клетки RPE [50 000 (низкая доза) и 100 000 (высокая доза)] были успешно доставлены в субретинальное пространство всех крыс RCS на P21 (фигура S6A), и было замечено эффективное образование пузырьков. Используемый здесь новый хирургический подход (трансклеральная субретинальная инъекция) был разработан для обеспечения последовательной доставки клеточной суспензии в субретинальное пространство без утечки клеток в стекловидное тело [21]. Одно животное не оправилось от анестезии во время инъекции и было исключено из исследования. Пороги оптокинетического отслеживания (OKT) измеряли через оба глаза каждого животного на 60 и 90 дни после рождения.Не было существенной разницы между глазами, получавшими высокие и низкие дозы клеток, в любом возрасте. Тем не менее, наблюдалось значительное восстановление пороговых значений OKT в глазах, обработанных как высокими, так и низкими дозами клеток, по сравнению с контролем, которым вводили носитель (рис. 6b). Значения OKT снизились в контрольных глазах с впрыском транспортного средства с P60 до P90, как и ожидалось. Однако такого снижения значений OKT не наблюдалось в глазах, обработанных как высокими, так и низкими дозами клеток. Это спасение, несмотря на ухудшение контроля, подчеркивает силу эффекта спасения.Следует отметить, что средние значения пороговых значений OKT для глаз, обработанных клетками, включают тех животных, у которых позже наблюдали, что у них не осталось оставшихся приживленных клеток, как оценивалось с помощью иммуногистохимии. Это, вероятно, привело к менее чем оптимальному спасению фоторецепторов у этих животных, потенциально снижая максимальную пользу трансплантированных клеток RPE, полученных из ИПСК.

Исследования эффективности клеток РПЭ in vivo после трансплантации в модели на животных. — количественное определение на основе ELISA белков поляризации, секретируемых в супернатантах культур in vitro — PEDF и VEGF в запущенных клетках RPE на 70 день и клетках, размороженных замораживанием; hiPSCs и клеточную линию ARPE-19 использовали в качестве отрицательного и положительного контролей соответственно. b — e Функциональный и молекулярный исход трансплантации RPE у крыс RCS. b Пороги оптокинетического отслеживания измерены у всех животных на P60 и P90. Звездочки указывают на статистическую значимость между контрольными группами, обработанными клетками, и контролями, инъецированными BSS +. c Гистологическая оценка с использованием данных окрашивания H&E на P60 и P90. d Окрашивание аррестином конуса в срезах сетчатки на P60 и P90. и Иммунофлуоресцентные изображения показывают присутствие трансплантированных клеток, обнаруженных с помощью ядерного маркера человека (HNA), окрашенного совместно с PMEL17, что указывает на выживание и приживление трансплантата.Масштабные линейки представляют 50 мкм

РПЭ поддерживают функциональную и структурную целостность сетчатки хозяина в течение длительных периодов времени

Все глаза выживших животных в исследовании ( n = 15) были успешно обработаны для гистологического исследования. После криосрезов и окрашивания была измерена толщина внешнего ядерного слоя (ONL) (рис. S6B) в качестве основного индикатора восстановления фоторецепторов, и показаны репрезентативные изображения срезов ткани с введенным носителем и клетками на P60 и P90 (рис.6в). На P60 глаза, обработанные клетками (височная область), имели значительно более толстые измерения ONL, чем необработанные области того же глаза. Интересно, что хотя инъекция BSS + привела к умеренному уровню защиты фоторецепторов в сетчатке, это не было сопоставимо с спасением, достигнутым после трансплантации RPE. Однако к P90 спасительный эффект BSS + ослабевает, и спасение наблюдается только в глазах, которым была проведена трансплантация RPE, что позволяет предположить, что BSS + имел временный эффект и что длительное спасение могло быть достигнуто только с помощью клеток RPE.На P90 сетчатка, обработанная клетками, имела значительно более толстый ONL, чем необработанные области того же глаза и глаза, обработанные BSS +. Группы, обработанные низкими и высокими дозами клеток, были объединены для количественной оценки толщины сетчатки и количества колбочек (рис. S6B), исключив высокую вариабельность и низкое количество, чтобы увеличить статистическую мощность, чтобы эти результаты могли быть более точным представлением четкого поведенческого и гистологическая консервация. Эти результаты показали, что обработанные клетками области сетчатки обеспечивали значительную сохранность ядер фоторецепторов, что соответствовало спасенным пороговым значениям OKT.

Иммуногистохимический анализ, основанный на совместном окрашивании HNA и PMEL17, выявил присутствие / выживаемость трансплантированных клеток RPE в обоих возрастах жертвоприношения (фиг. 6e). Однако количество выживших клеток уменьшалось с возрастом, и пересаженные клетки не обнаруживались у всех животных. У некоторых животных, у которых не удалось идентифицировать человеческие клетки, наблюдался приток макрофагов в области восстановления фоторецепторов, в которых отсутствовала зона дебриса, что указывает на то, где находились трансплантированные клетки до атрофии трансплантата.Признаки отторжения трансплантата наблюдались у 2 из 16 животных. В некоторых, но не во всех случаях, мы наблюдали, что небольшая часть трансплантированных человеческих клеток была положительной как по человеческому ядерному маркерному антигену, так и по Ki67 (рисунок S6C). Следует отметить, что уровень пролиферации был низким, и потенциальных онкогенных разрастаний не наблюдалось. Аррестин конуса был окрашен, и фоторецепторы колбочек были значительно сохранены с лучшей морфологией в обработанной клетками (височной) области глаза по сравнению с необработанной (носовой) областью того же глаза (рис.6г, S6B).

PRP привела к обнаруживаемым электрическим ответам у мышей NOD.SCID-rd1

Мышь NOD.SCID-rd1, разработанная в NII, Нью-Дели [15, 22], представляет собой модель двойного нокаута ( PDE6B — / — PRKDC− / — ), имитирующий RP с медленно прогрессирующей дегенерацией фоторецепторов. Модель лишена фоторецепторов из-за P28 и не имеет функционального адаптивного иммунитета. Четырехнедельные мыши ( n = 5 на группу) и любого пола (выбранные случайным образом) получали PRP на 55-й день (PRP55) или на 75-й день (PRP75), в то время как фиктивные животные получали только носитель (рисунок S6D). .Оба глаза получили 200 000 клеток в субретинальной области, и никаких признаков глазной травмы не наблюдалось. После трансплантации оценивали остроту зрения и электрофизиологические функции с помощью поведенческого аппарата и электроретинографии (ЭРГ) соответственно. Стимул ERG и поведенческие индикаторы измеряли с интервалом 15 дней после первой записи, при этом первое измерение производили на 2 день после трансплантации.

В ЭРГ амплитуда волны А указывает на то, что функция фоторецептора является следствием электрического ответа на световой раздражитель (рис.7а). Амплитуда волны B указывает на вторичную нейронную функцию сетчатки (рис. 7a), которая отвечает за передачу сигнала через сетевые нейроны, такие как биполярные и горизонтальные клетки. Обе группы PRP55 и PRP75 показали временное усиление спасения фоторецепторов, тем самым указывая на временное улучшение восприятия зрения по сравнению с фиктивным контролем (рис. 7b). Однако PRP55 продемонстрировал значительное функциональное спасение волны А на 15 и 30 дни (рис. 7a). Волна и волна B демонстрировали аналогичные модели улучшения амплитуды, что указывает на функциональную интеграцию нейроретины.

Исследования эффективности трансплантации PRP на мышах NOD.SCID-rd1 in vivo и их считывание. a Измерение электроретинографии, изображенное как волна A и волна B для PR55 и PRP75, трансплантированных животным. b Ответы поведенческих исследований в отношении восприятия света у обработанных животных. c H & E-окрашенные изображения срезов сетчатки после трансплантации Sham, PR55 и PR75 на 45 день. d Иммуногистохимическое окрашивание визуального аррестина у животных с трансплантированными PR55 и PRP75.Иммуноокрашивание e HNA показывает присутствие клеток сетчатки человека в сетчатке мыши через 45 дней трансплантации. Масштабные линейки представляют 100 мкм

Трансплантация PRP обеспечила временное улучшение зрительного восприятия

Поведенческое исследование светового восприятия измеряет остроту зрения и восприятие, поскольку мыши проявляют светобоязнь из-за их ночного образа жизни. Благодаря фото-восприятию животное переходит в темную камеру из светлой камеры и проявляет темновую задержку из-за фото-отвращения.Животные, которым пересажены PRP55 и PRP75, могли воспринимать яркий свет и, следовательно, испытывать светобоязнь, проводя все больше времени в темной камере со 2-го дня и, что наиболее важно, с 30-го по 45-й день (рис. 7b). После 45-го дня было обнаружено, что восприятие света ухудшилось, что указывает на снижение способности к спасению. В отличие от обработанных животных, мнимые контрольные животные не выказывали спасения ни в какой день и продолжали испытывать потерю восприятия из-за дегенерации сетчатки.По глубинному восприятию животные с остротой зрения предпочитают неглубокую сторону. Обе группы PRP55 и PRP75 показали предпочтительный переход к мелкой стороне до 30 дня по сравнению с фиктивными контролями (Рисунок S6E). Таким образом, переходные паттерны указывают на увеличение остроты зрения, хотя и кратковременное, в результате функциональной интеграции фоторецепторов.

Гистология и иммуногистохимическое окрашивание продемонстрировали нейрозащиту и выживаемость PRP.

Окрашивание залитых парафином глазных срезов гематоксилином и эозином (H&E) проводили для выявления морфологических изменений в сетчатке мышей на 45-й день после трансплантации (рис.7в). Сетчатка мышей с трансплантированным PRP55 показала небольшое, но заслуживающее внимания увеличение толщины слоя фоторецепторов по сравнению с фиктивными контролями и мышами с трансплантированным PRP75, что указывает на лучшую нейрозащиту. Воспалительной клеточной инфильтрации или каких-либо других гистологических изменений не наблюдалось. Иммуногистохимическое окрашивание аррестином зрения также показало увеличение толщины и целостности слоя фоторецепторов в группе PRP55, что подтверждает результаты H&E (рис. 7d). Затем мы решили окрашивать трансплантированные срезы на 45 день человеческим специфическим ядерным антигеном (HNA).В этот момент мы обнаружили клетки сетчатки PRP55 человека, интегрированные между внутренним ядерным слоем и слоем ганглиозных клеток сетчатки хозяина (рис. 7e). Хотя количество HNA-положительных клеток было ограниченным, их присутствие на 45 день после трансплантации является значительным. Этот результат согласуется с временным функциональным восстановлением, наблюдаемым с помощью ERG, и указывает на выживание и интеграцию клеток на 30-й день, которые не оценивались из-за небольшого количества животных.

Индуцированный гипоксией метаболический стресс в клетках пигментного эпителия сетчатки достаточен для индукции дегенерации фоторецепторов

Рецензент №2: У меня есть только несколько конкретных замечаний: авторы используют мышей Vegfa cKO, чтобы показать, что настоящая гипоксия вызывает аналогичные фенотипы, наблюдаемые у их мышей Vhl cKO.Однако время появления фенотипа кажется различным в двух моделях мышей. В своей публикации 2012 года авторы показывают, что хориокапилляры удаляются в течение трех дней после инактивации VEGF в RPE. Это должно привести к очень быстрому проявлению тяжелой гипоксии для РПЭ с последующей стабилизацией HIF1A и HIF2A. Тем не менее, авторы заявляют, что первые признаки гипоксии РПЭ наблюдались только через 6 месяцев после инактивации VEGF (подраздел «Аттенуация Choriocapillaris индуцировала гипоксию в РПЭ и способствует дегенерации фоторецепторов», первый абзац).Кроме того, дегенерация фоторецепторов наблюдается только очень поздно, через 18 месяцев после инактивации VEGF. Однако у мышей Vhl фенотипы появляются гораздо раньше.

Мы включили в этот пересмотр новый рисунок (рис. 8), сравнивающий начало фенотипа у обеих линий мышей. Трудно проводить прямые сравнения между линиями, но мы можем показать, когда впервые наблюдали центральные фенотипы с помощью наших инструментов.

Мы тоже были удивлены медленным прогрессированием заболевания у мутантов VEGF, учитывая тяжесть сосудистого инсульта.Мы согласны с тем, что фоторецепторы палочек могут получать минимальное питание, которое им требуется, из интраретинальных сосудов или, возможно, даже из соседних опорных клеток (хотя колбочки должны иметь возможность получать питание из тех же источников). Мы включили следующее заявление:

«[…] по неясным причинам палочковые фоторецепторы менее чувствительны к кислороду и недостатку питательных веществ, чем колбочки».

С этим связано удивительное открытие, что пимонидазол пометил РПЭ только у мышей Vegfa cKO (рис. 1B).Кроме того, клетки фоторецепторов РПЭ получают (большую часть) свой кислород из крови в сосудистой оболочке. Тем не менее, похоже, что они не становятся гипоксичными из-за истонченной сосудистой оболочки у этих мышей. Компенсируют ли интраретинальные сосуды хориоидальные дефекты у этих мышей? Может ли это объяснить очень позднее проявление дегенерации сетчатки у мышей Vegfa cKO? Позднее начало гипоксии и отсутствие накопления пимонидазола в фоторецепторах у мутантных мышей Vegfa также удивили нас. Это предположение, но хориоидальные нарушения могут быть компенсированы альтернативными сосудистыми источниками (интраретинальная сосудистая сеть, как предполагает автор обзора), РПЭ или глии Мюллера.Но мы также не можем исключить возможность того, что степень гипоксии на самых ранних стадиях ниже порога обнаружения с помощью наших инструментов. Поэтому мы добавили в рукопись этот отказ от ответственности:

«Однако мы не можем исключить возможность того, что гипоксия низкой степени может возникнуть в РПЭ или других клетках сетчатки раньше на подпороговых уровнях обнаружения».

Мыши Vhl cKO обнаруживают сильное накопление HIF1A и HIF2A в ядрах клеток RPE очень рано после абляции Vhl.Это может очень рано повлиять на метаболизм RPE. Судя по окрашиванию ZO-1 (рис. 2D), клетки RPE в Vhl cKO кажутся менее правильными по форме, а некоторые клетки выглядят немного крупнее. Проверяли ли авторы признаки гибели клеток РПЭ? Является ли РПЭ у старых мышей Vhl cKO здоровым?

Быстрые последующие изменения наблюдаются в клетках РПЭ у мутантов Vhl. Гипертрофия является центральной особенностью (количественно показано на рисунке 4C) наряду с массивным накоплением липидных капель и расширенными базальными складками. Хотя эти проявления возникают на ранней стадии, РПЭ стабильны в этом состоянии в течение нескольких недель, прежде чем наблюдаются более серьезные изменения.В конце концов, РПЭ кажутся очень нездоровыми и лишь слабо прилипают к мембране Бруха. На поздних стадиях дегенерации фоторецепторов наблюдаются значительные изменения, кровеносные сосуды начинают вторгаться во внешнюю сетчатку. Однако эти изменения происходят на поздних стадиях, поэтому мы не можем отличить специфические дефекты Vhl от ремоделирования сетчатки. Мы добавили рисунок 5 — дополнение к рисунку 2 и выписку:

«На поздних стадиях фенотипа наблюдаются драматические изменения RPE и сосудистой сети, соответствующие ремоделированию сетчатки (Рисунок 5 — рисунок в приложении 2) (Marc et al., 2003) ».

Кроме того, окрашивание ZO-1 может указывать на проблему в плотных контактах и, следовательно, на внешнем барьере между кровью и сетчаткой у мышей Vhl cKO. В то же время специфическая для РПЭ инактивация Vhl вызывает расширение сосудов сосудистой оболочки. Считали ли авторы, что это может привести к утечке крови через нарушенный внешний кровяной барьер сетчатки к сетчатке и к образованию отека? Может ли это быть частью относительно быстрого выпадения фоторецепторных клеток?

Это очень интересный вопрос.Мы выполняли ангиографию на нескольких стадиях развития заболевания и иногда наблюдали признаки утечки, но ничего определенного.

Накопление липидных капель очень любопытно. Подобное накопление (в основном ретинилового эфира) наблюдается при нокаутах Rpe65. Влияет ли инактивация Vhl на активность RPE65? Может ли это быть причиной снижения функции сетчатки? Честно говоря, это вопрос, который мы не рассматривали. Мы не пытались отличить липидные включения у мутантов Vhl от ретиносом, возникающих из-за дисфункции зрительного цикла.Однако мы можем утверждать, что липидные капли, наблюдаемые в нашем исследовании, являются результатом метаболических нарушений и гипоксии по следующим причинам: 1) группа Дуга Воллрата опубликовала рукопись в JCI (PMC3007156), демонстрирующую условное удаление OXPHOS в клетках RPE (с использованием Best1-Cre; Tfam ^{fl / fl} мышей) также вызывает массивное образование липидных капель и дегенерацию фоторецепторов; 2) Гиперстабильность HIF-2 связана с ингибированием OXPHOS и образованием липидных капель в других типах клеток.

Обсуждение: «В отличие от ретиносом, липидных капель, которые накапливаются в RPE из-за дефектов зрительного цикла (Imanishi, Gerke and Palczewski, 2004), липидные включения, наблюдаемые в гипоксических RPE, вероятно, являются побочным продуктом OXPHOS и дисрегуляции окисления жирных кислот, поскольку подобные включения ( и гипертрофия RPE и атрофия фоторецепторов) наблюдались у трансгенных мышей при условной инактивации OXPHOS в RPE ( Best1-Cre; Tfam ^{fl / fl} ) (Zhao et al., 2011) ».

Рецензент №3: Рукопись может быть улучшена с помощью:

1) Четкое определение временных проявлений (и последующих эффектов на фоторецепторы и RPE) у мутантных мышей VEGF и Vhl.

См. Новую фигуру 8 в этой редакции, на которой сравнивается временное начало центральных фенотипов для обеих линий.

2) Укажите, какой (и почему) из двух мутантов (VEGF или Vhl) более физиологически релевантен (особенно в контексте ВМД человека).

Мы утверждаем, что фенотип VEGF более релевантен с физиологической точки зрения. Условная потеря VEGF вызывает локальные и дифференцированные дефекты хориокапилляров, которые лучше отражают состояния у пациентов с AMD. Vhl cKO вызывает очень серьезное проявление, которое может наблюдаться только у пациентов с редкими мутациями, ведущими к хронической активации передачи сигналов HIF.

См. Пояснение к рисунку 8. «Изменения плотности хориокапилляров вызывают дифференцированную гипоксию у линии Vegfa cKO, как и у пациентов с AMD, что делает ее более физиологически значимой».

3) Опишите долгосрочные последствия VEGF и Vhl cKO. Наблюдается ли когда-либо неоваскуляризация у мутантов Vhl?

См. Наши ответы рецензенту №2 выше.Неоваскуляризация наблюдается на очень поздних стадиях заболевания. Однако мы не можем определить, возникает ли NV из-за хронической активации VEGF или из-за вторичных эффектов дегенерации сетчатки и ремоделирования сетчатки.

4) Отображаются только значения толщины ONL из различных элементов управления. Наблюдаются ли какие-либо изменения в RPE / choriocapillaris? Значения ERG могут быть включены.

Никаких изменений не наблюдалось в RPE / choriocapillaris, и значения ERG теперь включены в Рисунок 5 — приложение к рисунку 1C.

5) Предоставьте более подробную информацию о линии VMD2-Cre, особенно в отношении% рекомбинации.

Это утверждение было добавлено к результатам: «Трансгенных мышей, несущих cre ( VMD2-Cre ), направленный промотором желтообразной макулярной дистрофии-2 человека, использовали для удаления Vegfa ; у взрослых мышей VMD2-Cre; Vegfa ^{fl / fl} через три дня после индукции (dpi) наблюдается серьезное сужение сосудов choriocapillaris (Kurihara et al., 2012) ».

См. Также рисунок 1 — приложение к рисунку 1, на котором показан процент рекомбинации у мышей VMD-Cre .

6) Опишите значение видов с нарушенной регуляцией ацил-карнитинов в мутантах Vhl.

Обсуждение: «Идентификация широкого класса ацилкарнитинов в гипоксических РПЭ дает дополнительные доказательства общего метаболизма глюкозы и нарушений обработки липидов; определение комбинаций нарушенных ацилкарнитинов является информативным для диагностики дефектов окисления жирных кислот и других врожденных нарушений метаболизма (Rinaldo, Cowan and Matern, 2008) ».

7) Похоже, что индукция HIF (с повышенным содержанием VEGFA) оказывает большое влияние на метаболизм.Как влияет дефицит VEGFA на метаболизм? Авторы могут рассмотреть возможность оценки ключевого ферментативного профиля в гликолизе и окислительном фосфорилировании в комплексах RPE / сосудистой оболочки мышей Vegfa cKO; или использовать анализ морского конька для изучения изменений OCR с обработкой анти-VEGF в клетках RPE.

В то время как Vegfa значительно усиливается у мутантных мышей Vhl , он устраняется у мутантов Vegfa , но метаболический фенотип сохраняется в обеих линиях.Следовательно, Vegfa вряд ли вызовет метаболические дефекты, но мы не можем исключить возможность того, что повышенные уровни Vegfa в мутантах Vhl могут усугубить метаболические нарушения. Мы выполнили митохондриальное профилирование, как это было предложено, с клетками hRPE, обработанными Affilibercept (Eylea) и DMOG, и не наблюдали значительных изменений между контрольными, обработанными DMOG и обработанными DMOG / Eylea клетками RPE (изображение ответа автора 1).

8) Предполагается, что HIF2a играет ключевую роль в метаболическом переключении.Каковы потенциальные механизмы регуляции HIF2a при индукции гликолиза? Авторы, пожалуйста, прокомментируйте.

HIF1 и HIF2 активируют более 1000 генов в различных типах клеток, включая батарею генов метаболизма глюкозы и управления липидами. Интересно, что две изоформы активируют разные наборы генов на разных уровнях в зависимости от типа клетки. В то время как в большинстве сообщений говорится о причастности HIF1 к эффекту Варбурга, также было показано, что HIF2 является доминирующим регулятором OXPHOS и окисления жирных кислот при раке желудка и клетках светлоклеточной почечно-клеточной карциномы.Пожалуйста, смотрите это дополнительное заявление в тексте:

Результаты: «[…] предполагая, что HIF-2α, как и в других типах клеток (Qui et al., 2015; Zhao et al., 2015), является патологической изоформой HIF в гипоксических РПЭ».

Пигментный эпителий сетчатки по Олафу Штраусу — Webvision

Олаф Штраус

1. Введение.

Простейшие светочувствительные органы состоят из клеток двух типов: светочувствительной фоторецепторной клетки и пигментированной клетки.Оба типа клеток появляются вместе в каждом глазу животного царства, от насекомых, моллюсков до высших позвоночных [1]. Взаимодействия между пигментированными клетками и фоторецепторными клетками важны для зрительной функции [2-5]. Уже начиная с эмбрионального развития функциональная дифференцировка фоторецепторного слоя и слоя пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) зависит друг от друга [6, 7]. Когда связь между развивающимся РПЭ и развивающейся сетчаткой нейронов прерывается, РПЭ способен сам образовывать многослойную структуру, подобную сетчатке [8].

РПЭ и нервная сетчатка совместно дифференцируются во время развития глаза. Части взаимодействия РПЭ / фоторецептора, такие как импорт производного витамина А, retinal , его метаболизм и рециркуляция инициируются до начала зрения и служат сигналами дифференцировки для обеих тканей [9, 10]. Кроме того, анализ наследственных типов дегенерации сетчатки показывает сильную зависимость РПЭ от фоторецепторов и наоборот. Например, мутации в генах, которые экспрессируются в фоторецепторных клетках, могут привести к первичному заболеванию РПЭ с вторичной потерей фоторецепторов.Или, с другой стороны, мутации в генах, которые экспрессируются в RPE, могут привести к первичной дегенерации фоторецепторов. Таким образом, способность фоторецепторной клетки обнаруживать свет зависит от ее взаимодействия с пигментированной клеткой.

Рис. 1. Световая микрофотография пигментного эпителия сетчатки человека (слева) с сосудистыми оболочками вверху и сетчаткой внизу. Рисунок пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) (справа), выровненный рядом с микрофотографией.CC, choirocapillaris; BM — мембрана Бруха; РПЭ, пигментный эпителий сетчатки; апикальные отростки; os, наружные сегменты; С — конусы; R, стержни; М, клетки Мюллера

Рис. 2. Просвечивающая электронная микрофотография клеток РПЭ и интерфейса РПЭ-сосудистой оболочки глаза нормального человека-донора. CC, choirocapillaris; BM — мембрана Бруха; РПЭ, пигментный эпителий сетчатки; ros, внешние сегменты; ph, фагосомы; пг, пигментные гранулы

В глазу позвоночных РПЭ располагается между светочувствительными внешними сегментами фоторецепторов и кровоснабжением сосудистой оболочки.Это гексагонально упакованный, плотно соединенный, соединенный единый лист клеток, содержащий гранулы пигмента (рис. 1 и 2, PG) и органеллы для переваривания мембран внешнего сегмента фоторецепторов в фагосомы (рис. 2, Phagosomes, Ph). Своей апикальной мембраной и отростками (рис.1, ap) он обращен к субретинальному пространству, которое занято внеклеточным матриксом, специализированным для обеспечения взаимодействия между RPE и светочувствительными внешними сегментами фоторецепторов (рис.1 и 2, os , рос) [11-14].Своей базолатеральной мембраной РПЭ контактирует с высокоспециализированной многослойной мембраной Бруха (рис. 1 и 2), которая также представляет собой матрицу взаимодействия РПЭ с кровотоком в фенестрированных сосудах сосудистой оболочки (хориокапилляры, CC, рис. 1). и 2) [15].

На рис. 3 показан общий рисунок пигментного эпителия и его функциональных характеристик, которые будут обсуждаться в следующей главе.

Рисунок 3. Сводная диаграмма основных функций RPE (из Strauss, 2005 [2]).

Функции: поглощение света, эпителиальный транспорт, пространственная буферизация ионов, зрительный цикл, фагоцитоз, секреция и иммунная модуляция.

2. Поглощение света.

На первый взгляд, поглощение света — наиболее очевидная функция РПЭ. Клетки сильно пигментированы и покрывают внутреннюю поверхность луковицы. Как и в фотоаппарате, он улучшает качество оптической системы глаза за счет поглощения рассеянного света.Долгое время НПП считал эту функцию единственной. Теперь мы знаем очень много других функций РПЭ (см. Выше, рис. 3).

В человеческом глазу свет фокусируется линзой на клетки макулы, что приводит к сильной концентрации фотоокислительной энергии в сетчатке [16-18]. Более того, сосудистая оболочка — это ткань, которая показывает более высокую специфическую перфузию крови, чем почка [19-22]. Но извлечение кислорода сетчаткой во время прохождения через сосудистую оболочку относительно невелико.Венозная кровь из сосудистой оболочки по-прежнему показывает насыщение кислородом более 90%. Таким образом, РПЭ подвергается воздействию сильной фотоокислительной энергии со стороны сетчатки, а со стороны крови — за счет перетока кислорода. Фотоокисление приводит к повреждению кончиков внешних сегментов фоторецепторов, поэтому они нуждаются в постоянном процессе обновления от их основания (см. Главу «Фоторецепторы», Часть II, Webvision) (описывается ниже в разделе 6). Однако процесс обновления включает фагоцитоз разрушенных и сброшенных внешних сегментов фоторецепторов с помощью RPE.Это добавляет сильный заряд свободных радикалов в дополнение к высокой фотоокислительной среде. Таким образом, РПЭ должен быть способен поддерживать структурную целостность сетчатки за счет эффективной защиты от свободных радикалов, фотоокислительного воздействия и световой энергии [16-18].

Для этой цели RPE имеет несколько линий защиты, и первая линия — это меланосомы или пигментные гранулы [17]. В зависимости от цикла свет-темнота они перемещаются внутри цитоплазмы к апикальным отросткам в условиях освещения.Поглощение света меланосомами приводит к нагреванию комплекса РПЭ / хориоидеи до температур выше 40 ^o

С [23, 24]. Возможно, что высокая перфузия сосудистой оболочки глаза служит для отвода тепла от сетчатки. Дополнительными линиями защиты являются высокие концентрации неферментативных и ферментативных антиоксидантов и способность клеток восстанавливать поврежденные липиды, белки и ДНК. У человека эти механизмы обеспечивают защиту комплекса фоторецептор / RPE / сосудистую оболочку и поддержание структурной целостности этого комплекса в течение десятилетий.Однако известно, что сетчатка человека накапливает липофусцин (конечный продукт распада фагосом) в течение своей жизни, начиная с раннего возраста. Это накопление ослабляет клетки РПЭ, и их линии защиты со временем ослабевают [17, 25-29]. Считается, что снижение способности поглощать свет и компенсировать окислительное повреждение являются важными факторами, инициирующими цепочку событий, ведущих к началу возрастной дегенерации желтого пятна у пожилых людей (см. Главу о ВМД Хагемана и др., Webvision) .

3. Эпителиальный транспорт.

Таким образом, РПЭ образует плотный эпителий, расположенный между кровотоком сосудистой оболочки и внешними сегментами фоторецепторов. Между боковыми поверхностями гексагонального эпителиального листа имеется плотный стык (рис. 2, TJ) [4, 30, 31]. Таким образом, RPE образует часть барьера кровь / сетчатка. Барьерная функция плотного эпителия подразумевает эффективную изоляцию внутренней сетчатки от системных влияний на хориоидальной стороне.Это важно для иммунной защиты глаза (см. Раздел 8) и для высокоселективного транспорта между кровью и субретинальным пространством. Этот эпителиальный транспорт служит для доставки питательных веществ к фоторецепторам (транспортировка из крови в сторону сетчатки), контроля ионного гомеостаза в субретинальном пространстве и удаления воды и метаболитов из ткани сетчатки (транспортировка из сетчатки в сторону крови).

Транспорт со стороны крови к сетчатке:

Фоторецепторы — это узкоспециализированные клетки, которым необходимо снабжение жизненно важными метаболитами.Это глюкоза для энергетического метаболизма, сетчатка для зрительного цикла опсинов и ω-3 жирные кислоты для специализированных фосфолипидов, составляющих мембраны фоторецепторов, которые сильно обогащены ω-3 жирными кислотами. Все эти питательные вещества поглощаются РПЭ и транспортируются к фоторецепторам. Чтобы транспортировать глюкозу, RPE экспрессирует транспортеры глюкозы GLUT1 и GLUT3 как в апикальной, так и в базолатеральной мембране [32, 33]. GLUT3 служит для основного транспорта, тогда как GLUT1 отвечает за индуцибельную транспортную систему для удовлетворения метаболических потребностей.Транспортировка сетчатки начинается с поглощения ретинола из крови, а затем переносится в зрительный цикл сетчатки, который описан ниже (Раздел 5). Чтобы транспортировать ω-3 жирные кислоты, РПЭ предпочтительно поглощает 22: 6ω3 жирную кислоту в зависимости от концентрации [34, 35]. Внутри RPE соединение включается в глицеролипиды для синтеза, хранения и последующей доставки в процессе рециркуляции, включающем процесс фагоцитоза (см. Раздел 6).

Транспорт из субретинального пространства в кровь:

В основном вода, ионы и конечные продукты метаболизма переносятся со стороны сетчатки на сторону крови [4, 30, 31, 36, 37].Сетчатка — это ткань с самой высокой плотностью клеток в организме человека. Фоторецепторы, нейроны и глиальные клетки обладают высокой скоростью метаболизма, что приводит к выработке метаболической воды, которая накапливается в сетчатке. Кроме того, внутриглазное давление вызывает движение воды от переднего отдела глаза к сетчатке, где она накапливается. Кроме того, большая часть метаболической активности клеток сетчатки приводит к выработке молочной кислоты. Сообщается о концентрации молочной кислоты в субретинальном пространстве до 19 мМ [38].

Рисунок 4. Эпителиальный транспорт и регуляция pH в клетках RPE. A. Трансэпителиальный транспорт ионов через RPE: Cl

Вода удаляется из субретинального пространства за счет активного транспорта с помощью RPE. Скорость транспортировки оценивается в диапазоне от 1,4 до 11 мкл x см-2 x час-1 [39-41]. Этот транспорт воды управляется трансэпителиальным транспортом Cl- из субретинального пространства в кровь через RPE (Fig. 4A). Транспорт Cl- — это активный транспорт, управляемый активностью апикально локализованной Na + / K + -АТФазы, которая использует энергию АТФ для транспортировки 3 Na + в обмен на 2 Ka + против градиентов концентрации из клеток RPE.Ионы K +, которые транспортируются в цитоплазму, рециркулируют через апикально локализованные внутренние выпрямительные каналы Kir7.1 K + в субретинальное пространство [42]. Это приводит к градиенту Na + в клетке RPE, которая имеет низкую внутриклеточную концентрацию Na +. Рециркуляция K + обратно в субретинальное пространство через внутренние каналы K + выпрямителя увеличивает эффективность транспорта Na + / K + -ATPase, потому что это уменьшает градиент K + через апикальную мембрану RPE [43]. Причина, по которой Na + / K + -АТФаза расположена апикально, не ясна.Как будет объяснено ниже в разделе 4, он, вероятно, служит для поддержания ионного гомеостаза в субретинальном пространстве за счет пространственной буферизации ионов. Управляемый Cl транспорт воды устанавливает силу адгезии между RPE и сетчаткой нейрона, которая удаляется путем блокирования Na + / K + -АТФазы с помощью уабаина [44].

Транспортный путь начинается с поглощения Cl- из субретинального пространства через апикальную мембрану клеток RPE. Управляемый градиентом Na +, который устанавливается Na + / K + -АТФазой, Cl- попадает в клетку через апикальную мембрану за счет активности котранспортера Na + / K + / 2Cl- [4, 30, 36, 45 ].Поскольку K + рециркулирует обратно через апикальные внутренние каналы выпрямителя в субретинальное пространство, а Na + транспортируется из клетки с помощью Na + / K + -АТФазы, транспортная активность котранспортера Na + / K + / 2Cl- в основном приводит к накоплению Cl- внутри клеток РПЭ. В зависимости от вида внутриклеточная активность Cl- колеблется от 20 до 60 мМ [46-48]. Поскольку базолатеральная мембрана имеет большую проводимость Cl-, Cl-, который накапливается во внутриклеточном пространстве RPE, покидает клетку через базолатеральную мембрану в сторону крови.Это приводит к базолатеральному отрицательному трансэпителиальному потенциалу в диапазоне 5-15 мВ [30, 31].

Решающим шагом в этом пути транспорта является проводимость базолатеральной мембраны для Cl-. Таким образом, механизмы, которые регулируют путь оттока через базолатеральную мембрану, регулируют общий эпителиальный транспорт Cl- через RPE. С этой целью в базолатеральной мембране локализуются разные типы Cl- каналов, которые отличаются своими механизмами активации, чтобы связать проводимость Cl- с разными путями вторичных мессенджеров клеток RPE.Базовая скорость транспортировки, по-видимому, обеспечивается каналом ClC-2 Cl- [49].

В модели мышей с нокаутом ClC-2 Cl- каналов наблюдается отсутствие трансэпителиального потенциала, и мыши становятся слепыми, показывая фенотип, сравнимый с фенотипом пигментного ретинита [49]. Другим базолатеральным Cl- каналом может быть CFTR (трансмембранный регулятор кистозного фиброза), который обеспечивает цАМФ-зависимую модуляцию транспорта Cl- через базолатеральную мембрану [50, 51] и Ca2 + -зависимый Cl- канал, который позволяет регулировать транспорт. изменением внутриклеточного Ca2 +.Молекулярная идентичность этого Cl-канала, возможно, соответствует бестрофину-1 [52].

Как упоминалось выше, метаболическая активность приводит к большим концентрациям молочной кислоты в субретинальном пространстве. Молочная кислота выводится из субретинального пространства с помощью RPE [37, 53] (рис. 4B). Поглощение молочной кислоты происходит через апикальную мембрану RPE с помощью переносчика монокарбоксилата-1 MCT1, а высвобождение молочной кислоты в кровь через базолатеральную мембрану происходит за счет активности переносчика монокарбоксилата-3 (MCT3). .Транспортировка молочной кислоты требует эффективного регулирования pH и адаптации объемного транспорта, потому что большое количество транспортируемой воды является метаболической водой. В регуляции pH клеток RPE задействована активность связанных с Na ⁺ вторичных активных транспортных механизмов апикальной мембраны RPE [54, 55]. Ионы H ⁺ удаляются из цитоплазмы с помощью Na ⁺ / H ⁺ -обменника, а HCO3 ^— накапливается в цитозоле за счет транспортной активности Na ⁺ / 2HCO3 ^— со- транспортер [56].На базолатеральной мембране RPE обменник HCO3 ^— / Cl ^— мешает контролю внутриклеточного HCO3 ^— апикальным ко-транспортером Na ⁺ / 2HCO3 ^— . При высоком pH РПЭ переносит HCO3 ^– из субретинального пространства в кровь. При низком pH стимулируется базолатеральный обменник HCO3 ^— / Cl ^— , что увеличивает внутриклеточную концентрацию HCO3 ^— и HCO3 ^— , высвобождаемых в субретинальное пространство через апикальную мембрану под действием Na ⁺ . / HCO3 ^–, сопутствующий транспортер, который затем работает в реверсивном режиме.

Участие обменника HCO3- / Cl- на базолатеральной мембране связывает транспорт воды с регуляцией pH и, следовательно, с транспортом молочной кислоты [46, 47, 56-62]. В условиях покоя обменник HCO3- / Cl- в базолатеральной мембране снижает скорость транспортировки Cl- через базолатеральную мембрану и, следовательно, трансэпителиальный транспорт объема, поскольку небольшое количество Cl-, которое покидает клетку, через базолатеральную мембрану. Cl- каналы транспортируются обратно во внутриклеточное пространство за счет активности HCO3- / Cl- обменника.При низком pH обменник HCO3- / Cl- транспортирует Cl- из клетки для поглощения HCO3- для регулирования pH, что, в свою очередь, приводит к увеличению переноса Cl- и объема. Это подтверждается чувствительностью к pH базолатерального канала ClC-2 Cl, который увеличивает его активность за счет снижения внеклеточного pH. Тот факт, что перенос объема связан с транспортом HCO3, используется при лечении отека желтого пятна. Применение ингибиторов карбоангидразы увеличивает скорость резорбции объема РПЭ [62, 63].Транспорт осмолитов через RPE из субретинального пространства в сторону крови устанавливает осмотическую движущую силу для воды через RPE.

РПЭ представляет собой плотный эпителий, что означает, что транспортировка воды не может происходить ни по каким параклеточным путям транспортировки. Весь транспортируемый объем должен идти по трансклеточному маршруту. С этой целью РПЭ экспрессирует водные каналы аквапорина-1, которые локализованы как в базолатеральной, так и в апикальной мембране РПЭ [64, 65].Однако также было высказано предположение, что транспортеры монокарбоксилата способны транспортировать воду.

4. Пространственная буферизация ионов

Как описано выше, RPE поддерживает ионный гомеостаз субретинального пространства за счет эпителиального транспорта ионов. Однако светозависимые изменения активности фоторецепторов и активности нейронов второго порядка приводят к очень быстрым изменениям в субретинальном пространстве, что требует быстрой и емкой компенсации со стороны RPE [66].Если бы эти изменения не были компенсированы, общая возбудимость фоторецепторов и нейронов быстро изменилась бы, и правильная передача сигнала зрительной информации была бы невозможна. Нормальный трансэпителиальный транспорт ионов будет слишком медленным, чтобы достаточно быстро компенсировать эти изменения.

Другие механизмы, основанные на активности потенциал-зависимых ионных каналов, добавляют к основному трансэпителиальному транспорту ионов. В этом процессе наиболее важна компенсация изменений субретинальной концентрации K + и объема сетчатки.В темноте катионные каналы с цГМФ открыты во внешних сегментах фоторецепторов. Приток Na + и Ca2 + через эти каналы уравновешивается оттоком K + во внутреннем сегменте. Эти ионные токи представляют собой так называемый темновой ток [67]. Когда свет падает на внешние сегменты фоторецепторов, cGMP-зависимые катионные каналы закрываются, и отток K + во внутреннем сегменте становится меньше. В то же время Na + / K + -АТФаза во внутреннем сегменте поглощает K + в фоторецептор.Это приводит к снижению концентрации K + в субретинальном пространстве с 5 мМ до 2 мМ [4, 66]. Это снижение компенсируется РПЭ. Механизм основан на том факте, что в ионной проводимости апикальной мембраны РПЭ преобладает проводимость K + [36]. Снижение субретинальной концентрации К + под действием света приводит к гиперполяризации апикальной мембраны РПЭ. Это, в свою очередь, приводит к активации внутренних каналов выпрямителя K +, генерирующих отток K + в субретинальное пространство, и к увеличению субретинальной концентрации K + до нормальных значений [68].Для этого RPE экспрессирует каналы Kir7.1, расположенные в апикальной мембране RPE [69]. Было обнаружено, что каналы Kir7.1 демонстрируют довольно мягкую ректификацию, но показывают повышенную проводимость, когда внеклеточный K + снижается. Это делает эти K + каналы идеальными кандидатами на эту функцию [42, 70]. Этот компенсаторный путь позволяет быстрым реакциям РПЭ либо уменьшать, либо увеличивать субретинальную концентрацию K +.

Модель, разработанная LaCour, объясняет компенсацию изменений концентрации K + эпителиальным транспортом довольно небольшим трансэпителиальным транспортом K + из субретинального пространства в сторону крови в контрольных условиях [68, 71].Основная часть K +, которая захватывается через апикальную мембрану за счет активности ко-транспортера Na + / K + / 2Cl-, возвращается обратно в субретинальное пространство через апикальные каналы K +. Меньшая часть покидает клетку через базолатеральную мембрану в сторону крови. При уменьшении субретинальной концентрации K + проводимость апикальной мембраны для K + увеличивается. Это приводит к увеличению доли K +, который возвращается обратно в субретинальное пространство, и, следовательно, к дальнейшему снижению трансэпителиального транспорта K + посредством RPE.В ситуации, когда субретинальная концентрация K + увеличивается, проводимость апикальной мембраны снижается из-за инактивации каналов Kir7.1 и из-за деполяризации апикальной мембраны. Теперь меньшая часть K +, которая поглощается апикальной мембраной, может возвращаться обратно в субретинальное пространство. Это увеличивает количество K +, который транспортируется через RPE в кровь. Благодаря быстрой связи концентрации K + с апикальным трансмембранным потенциалом и ионной проводимостью, RPE способен реагировать на изменения субретинальной концентрации K + так же быстро, как они происходят.

Когда сетчатка стимулируется светом, наблюдается небольшое и временное изменение внеклеточного объема в сетчатке [36, 72]. Эти изменения компенсируются клетками глии Меллера во внутренней сетчатке и RPE на внешней сетчатке. Опять же, механизм компенсации представляет собой быструю реакцию, которая добавляет к устойчивому трансэпителиальному транспорту с помощью РПЭ, в данном случае транспорту воды. Быстрая связь снова обеспечивается зависимой от напряжения модуляцией переноса ионов. Как описано выше, транспорт воды в РПЭ осуществляется трансэпителиальным транспортом Cl-, который связан с транспортом HCO3- и лактата.Светозависимая модуляция водного транспорта основана на том факте, что апикальный ко-переносчик Na + / HCO3- является электрогенным. Это означает, что эта транспортная активность не является электронейтральной, потому что она не переносит эквивалентное количество положительных и отрицательных зарядов [56, 73-75]. Светозависимая гиперполяризация апикальной мембраны снижает скорость переноса котранспортера Na + / HCO3-, что, в свою очередь, приводит к внутриклеточному закислению. Как описано выше, транспорт воды может быть усилен за счет внутриклеточного подкисления, которое приводит к усиленному оттоку Cl- через базолатеральную мембрану RPE.

5. Визуальный цикл

Зрение начинается с поглощения фотона хромофором родопсина, 11-цис-ретиналя [67, 76-78]. После поглощения фотона 11-цис-ретиналь изменил свою конформацию на полностью транс-ретиналь, и родопсин превратился в мета-родопсин за определенное время, прежде чем его активность прекратилась фосфорилированием. После дополнительных стадий реакции родопсин способен заменять полностью транс-ретиналь на 11-цис-ретиналь, и он снова может быть активирован фотоном.Таким образом, полностью транс-ретиналь необходимо повторно изомеризовать, чтобы обеспечить достаточную доставку 11-цис-ретиналя для всех зрительных потребностей и правильной зрительной функции [1, 79]. Поскольку фоторецепторы не экспрессируют ре-изомеразу для полностью транс-ретиналя, ре-изомеризация происходит в RPE. Для этого полностью транс-ретиналь доставляется в РПЭ, повторно изомеризуется в 11-цис-ретиналь и доставляется обратно к фоторецепторам. Этот процесс называется зрительным циклом сетчатки [80–82, см. Также главу о фототрансдукции, часть V в Webvision].Визуальный цикл для стержней происходит через RPE (рис. 5). Визуальный цикл для шишек менее ясен. Может случиться так, что часть колбочки, полностью транс-ретиналь, повторно используется РПЭ, а часть — клетками глии Мюллера.

Рисунок 5. Зрительный цикл (адаптировано из Томпсона и Гал (597). Преобразование света начинается с поглощения фотона родопсином. Процесс поглощения света лежит в основе стереохимического преобразования 11-цис-ретиналя в полностью транс-сетчатку. Полностью-транс-ретиналь метаболизируется в полностью транс-ретинол и транспортируется в RPE.В РПЭ ретинол повторно изомеризуется в 11-цис-ретиналь, а затем повторно доставляется к фоторецепторам. Регенерация, кажется, идет двумя путями. Один происходит через еще не идентифицированный фермент, который, как полагают, функционирует как изомерогидролаза. Второй путь включает светозависимый путь с использованием рецептора, сопряженного с G-белком сетчатки и RPE, который после поглощения света изомеризует полностью транс-ретиналь в 11-цис-ретиналь. Сокращения: CC, choidocapillaris; BM — мембрана Бруха; ОС, внешние сегменты; AP, апикальные отростки; IRBP, интерстициальный белок, связывающий сетчатку; CRBP, клеточный ретинол-связывающий белок; CRALBP, клеточный белок, связывающий ретинальдегид; atRDH, полностью транс-ретинолдегидрогеназа; 11cRDH, 11cis ретинолдегидрогеназа; LRAT, лецитин-ретинол-ацилтрансфераза; RPE65, специфический для RPE белок с молекулярной массой 65 кДа; RGR, рецептор, связанный с G-белком сетчатки глаза; RBP / TTR, комплекс ретинол-связывающего белка / транстиретина.(По материалам Thompson and Gal, 2003 [132]).

Зрительный цикл палочек начинается в дисках во внешних сегментах, где полностью транс-ретиналь переносится из внутридискового пространства в цитозольное пространство внешнего сегмента палочек с помощью АТФ-управляемой флиппазы ABCR или ABCA4 (белок АТФ-связывающей кассеты) . Этот этап включает реакцию полностью транс-ретиналя с фосфатидилэтаноламином с образованием N-ретинилидин-фосфатидилэтаноламина. На следующем этапе полностью транс-ретиналь восстанавливается до полностью-транс-ретинола с помощью мембраносвязанной ретинол-дегидрогеназы и доставляется в субретинальное пространство, где загружается IRBP (интерстициальный связывающий белок сетчатки), белок-носитель, и транспортируется в субретинальное пространство. RPE.После поглощения RPE полностью транс-ретинол переносится в CRBP (клеточный ретинол-связывающий белок), который доставляет полностью транс-ретинол в белковый комплекс из нескольких ферментов. Этот комплекс состоит из LRAT (лецитин: ретинолтрансфераза), RPE65 (белок RPE с 65 кДа) и RDH5 (11-цис-ретинолдегидрогеназа). Три фермента катализируют трехстадийную реакцию от полностью транс-ретинола до 11-цис-ретиналя: этерификация ретинола путем добавления айкл-группы (LRAT), ре-изомеризация до 11-цис с использованием энергии гидролиза сложного эфира (RPE65) и окисление до 11-цис-ретиналя (RDH5).Реакция ускоряется CRALBP (клеточный ретинилальдегид-связывающий белок), который также является частью ферментного комплекса и в который немедленно переносится 11-цис-ретиналь. Из CRALBP 11-цис-ретиналь высвобождается в IRBP и транспортируется обратно к фоторецепторам. Точные механизмы, с помощью которых полностью транс-ретинол входит в РПЭ и с помощью которых 11-цис-ретиналь покидает РПЭ, неясны.

Зрительный цикл выполняет важную задачу по поддержанию зрительной функции и, следовательно, должен быть адаптирован к различным зрительным потребностям, таким как зрение в темноте или на свету [1, 79].Для этого в игру вступают функциональные аспекты: накопление сетчатки и адаптация скорости реакции. В основном зрение при низкой интенсивности света требует более низкой скорости смены зрительного цикла, тогда как при свете скорость смены направления намного выше. При внезапном переходе от темноты к свету требуется большое количество сетчатки 11 цис. Это происходит не напрямую из зрительного цикла, а из нескольких ретинальных пулов связывающих белков сетчатки, которые связаны друг с другом этапами транспортировки и реакции зрительного цикла.Первый пул — это количество 11-цис-ретиналя, которое находится во внешних сегментах стержня. Когда уровень этого пула снижается, то пополнение этого пула начинается за счет поглощения сетчатки из следующего пула: IRBP в субретинальном пространстве. Падение уровня сетчатки в этом пуле пополняется за счет CRALBP, который может быть восполнен из RPE65. С помощью подключенных бассейнов для сетчатки из 11 цис можно быстро адаптировать изменения освещенности. Таким образом, РПЭ играет решающую роль в зрительной функции, в световой адаптации.RPE65 играет двойную решающую роль в зрительном цикле [83, 84]. С одной стороны, он катализирует реакцию ре-изомеризации при световых условиях. В темноте он действует как связывающий ретинол белок и представляет собой важный пул ретинола для зрительного цикла. RPE65 сочетает в себе обе важные функции для адаптации зрительного цикла: накопление и ферментативную реакцию.

6. Фагоцитоз наружных мембран фоторецепторов

Как упоминалось выше, внешние сегменты светочувствительных фоторецепторов (POS) подвергаются постоянному разрушению из-за фотоокислительного повреждения.Для поддержания зрения POS постоянно обновляются за счет удаления разрушенных кончиков POS и фагоцитоза POS пигментным эпителием сетчатки [3, 4, 85-89]. Это суточно регулируемый процесс, который происходит утром и запускается светом [86-88, 90-93]. Обновление внешнего сегмента фоторецептора по всей длине занимает примерно одиннадцать дней. Ночные активные или дневные животные демонстрируют одинаковый суточный ритм фагоцитоза [94]. В этом процессе правильная длина внешних сегментов фоторецептора поддерживается за счет скоординированной активности фагоцитоза и шеддинга POS.Этот процесс регулируется не только циркадным ритмом, но и координацией между RPE и фоторецепторами.

Рисунок 6. Фагоцитоз. На рисунке показаны молекулы, участвующие в инициации фагоцитоза внешнего сегмента фоторецептора. Инициирование начинается со связывания мембран внешнего сегмента фоторецепторов. Событие связывания преобразуется во внутриклеточный сигнал, повышение уровня внутриклеточного InsP3, что, в свою очередь, приводит к попаданию в организм связанных мембран внешнего сегмента фоторецепторов.Связывание, вероятно, опосредуется интегринами, а передача сигнала происходит через рецепторную тирозинкиназу MerTK. При проглатывании участвует рецептор макрофагов CD36. Скоординированная передача сигнала происходит посредством взаимодействия интегрина и MerTK через киназу фокальной адгезии. Сокращения: CD36, рецептор фагоцитоза макрофагов; FAK, киназа фокальной адгезии; Gas6, белок 6, специфичный для остановки роста; InsP3, инозитол-1,4,5-трифосфат; MerTK, c-мер рецепторной тирозинкиназы; PLC, фосфолипаза C; POS, внешний сегмент фоторецептора.(Из Strauss, 2005 [2]).

В первую очередь было идентифицировано три рецептора, участвующих в регуляции фагоцитоза POS с помощью RPE (рис. 6, выше): CD36, c-мер рецептор-тирозинкиназа (MerTK) и α _V β ₅ интегрин [ 95-102]. В основном CD36 необходим для процесса интернализации POS, MerTK требуется для активации фагоцитоза, а интегрин α _V β ₅ необходим для связывания POS и для инициации фагоцитоза в дневном состоянии.Взаимодействие между этими рецепторами обеспечивает регулируемый и скоординированный фагоцитоз POS. Релевантность этих рецепторных молекул в клеточной мембране была раскрыта в фенотипах различных животных с нокаутом. Потеря MerTk приводит к пигментному ретиниту человека и сопоставимому типу дегенерации сетчатки у крыс из Королевского колледжа хирургов (RCS), которая представляет собой старейшую животную модель наследственной дегенерации сетчатки [100-102]. Потеря β5-интегрина приводит к потере циркадной регуляции фагоцитоза с последующим поздним началом накопления липофусцина в RPE [97–99].

Неизвестно, какая сигнальная молекула обеспечивает связь между RPE и фоторецепторами в начале фагоцитоза. Возможно, что присутствия сброшенных POS достаточно для инициации фагоцитоза [103]. Первым шагом в этом процессе является связывание POS с RPE через интегрин αVβ5. Секретируемая гликопротеиновая глобула молочного жира-EGF8 (MFG-8), которая экспрессируется RPE и может активировать интегрин αVβ5, по-видимому, является важным активатором суточной стимуляции фагоцитоза [104-106].Активация интегрина вызывает внутриклеточный сигнальный каскад, в котором участвует киназа фокальной адгезии (FAK) [98]. FAK способен фосфорилировать MerTK, который теперь может быть активирован. Механизм активации MerTK не ясен. Естественным лигандом для MerTK является белок под названием Gas6 (белок 6, специфичный для остановки роста). Gas6 обнаружен в сетчатке и сильно экспрессируется RPE [107]. Таким образом, может быть, что Gas6 является аутокринным стимулятором фагоцитоза RPE.

Однако недавняя публикация предположила, что, вероятно, играет роль другой лиганд для MerTk.В этой публикации было показано, что тубби и тубби-подобные белки, которые обнаруживаются в фоторецепторах, могут связываться с MerTK и представлять сигналы «съешь меня» для процесса фагоцитоза клетками РПЭ (а также для макрофагов) [108] . Активация MerTK приводит к внутриклеточному сигнальному каскаду, который включает образование инозитол-1,4,5-трифосфата (InsP3) и последующее увеличение внутриклеточного свободного Ca ²⁺ . Сам по себе фагоцитоз активируется рецептором фагоцитоза CD36.

7. Секретность

РПЭ представляет собой эпителий, который тесно взаимодействует с фоторецепторами с одной стороны, но также должен иметь возможность взаимодействовать с клетками эпителия со стороны крови, такими как эндотелиальные клетки или клетки иммунной системы. Чтобы общаться с соседними тканями, RPE способен секретировать большое количество факторов и сигнальных молекул. Он секретирует АТФ, fas-лиганд (fas-L), факторы роста фибробластов (FGF-1, FGF-2 и FGF-5), трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), инсулиноподобный фактор роста-1 ( IGF-1), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста эпителия хрусталика (LEDGF), члены семейства интерлейкинов, тканевый ингибитор матриксной металлопротеазы (TIMP) и фактор, производный от пигментного эпителия (PEDF) [2].

В здоровом глазу некоторые из этих факторов постоянно высвобождаются и помогают поддерживать структурную целостность соседних тканей. PEDF представляет собой, например, нейротрофический фактор, который секретируется апикальной / ретинальной стороной RPE для стабилизации нейронов сетчатки путем предотвращения апоптоза [109–111]. VEGF и TIMP секретируются на базолатеральную сторону RPE и необходимы для стабилизации фенестрированной структуры эндотелия сосудистой оболочки [112]. Другие факторы активируются, когда сетчатка или РПЭ подвергаются патологическим состояниям, таким как гипоксия или метаболический стресс.Чтобы сделать возможной тонко регулируемую секреторную активность RPE при здоровье и болезни, RPE экспрессирует ряд Ca ²⁺ -зависимых регуляторных механизмов [113] (рис. 7 и 8). Если регулирование секреции не удается при определенных патологиях, то RPE будет способствовать пролиферативным заболеваниям, таким как хориоидальная неоваскуляризация.

Рис. 7. В здоровом глазу RPE секретирует нейротрофический фактор PEDF в субретинальное пространство на апикальной стороне RPE.Ангиогенный фактор, VEGF, секретируется с базолатеральной стороны во внеклеточный матрикс, где он стабилизирует эндотелий хориокапилляров и помогает поддерживать его фенестрацию. Клетки РПЭ экспрессируют нейроэндокринный подтип каналов L-типа Ca

Основным триггером секреторной активности в РПЭ является увеличение внутриклеточных свободных вторичных мессенджеров Ca ²⁺ . Чтобы регулировать секрецию, специфичную для различных факторов, RPE экспрессирует большое количество различных ионных каналов или переносчиков, которые увеличивают внутриклеточный свободный Ca ²⁺ . Как и во многих других секреторных тканях, таких как бета-клетки поджелудочной железы или нейроэндокринные клетки, RPE экспрессирует потенциал-зависимые каналы Ca ²⁺ нейроэндокринного подтипа.Последние состоят из подтипа Ca _V 1.3 [114–116]. В RPE канал L-типа регулируется либо цитозольными тирозинкиназами, такими как киназа src-типа, либо рецепторной тирозинкиназой, такой как рецептор FGF FGFR-2 [117-119]. Поскольку известно, что большое количество факторов увеличивает секрецию RPE, действуя через тирозинкиназу, канал L-типа регулирует ряд различных факторов.

Другой канал Ca ²⁺ , который, как полагают, участвует в регуляции секреции фактора роста с помощью RPE, представляет собой канал TRPV2 (канал временного рецепторного потенциала, ваниллоидный подтип) [120].Активация этого канала приводит к повышенной секреции VEGF RPE. Похоже, что в основном стимулированный IGF-1 VEGF увеличивается за счет сигнального каскада, включающего активацию TRPV2. Этот ионный канал — интересный кандидат для понимания некоторых клинических наблюдений. Каналы TRPV2 могут быть активированы теплом. А зависимая от тепла активация каналов TRPV2 может стимулировать секрецию VEGF. Лазерное лечение, которое вызывает повышение температуры РПЭ, часто используется при лечении дегенеративных изменений, таких как AMD или диабетическая ретинопатия.Такое же лазерное лечение, скорее всего, вызывает увеличение секреции факторов роста из RPE, и, возможно, активация TRPV2 позволяет эту секрецию.

8. Иммунная привилегия глаза

Внутренний глаз представляет собой привилегированное иммунное пространство, которое отключено от иммунной системы кровотока [121-123]. Иммунная привилегия поддерживается RPE двумя способами. Во-первых, он представляет собой механический и плотный барьер, отделяющий внутреннее пространство глаза от кровотока.Во-вторых, RPE способен связываться с иммунной системой, чтобы заглушить иммунную реакцию в здоровом глазу или, с другой стороны, активировать иммунную систему в случае заболевания (рис. 8). Для этих целей RPE может секретировать иммуномодулирующие факторы, такие как интерлейкин-8 (IL-8) [124], фактор комплемента H (CFH) [125, 126] или хемотаксический белок моноцитов-1 (MCP1) [127]. Также RPE способен реагировать на различные факторы иммунных сигнальных каскадов путем экспрессии соответствующих рецепторов.Рецепторами являются рецепторы MHC [128, 129], толл-подобные рецепторы [130] или рецепторы для сигнальных молекул, таких как фактор некроза опухоли-α (TNF-α) [131].

Рисунок 8. Передача сигналов фактора роста в RPE. Стимуляция секреции RPE и сводка секретируемых молекул по их функциональной роли. Триггером секреции являются Ca

В последнее время растет интерес к информации о том, что RPE может взаимодействовать с иммунной системой. Многие типы дегенерации сетчатки, по-видимому, связаны с недостаточностью подавления иммунных реакций, например, при возрастной дегенерации желтого пятна (см. Главу Hageman et al.webvision). С другой стороны, понимание иммунной привилегии RPE будет полезно при лечении дегенерации сетчатки путем инъекции пептидов, генной терапии с помощью вирусов или в подходах с использованием трансплантации.

9. Ссылки

1. Лэмб Т.Д., Коллин С.П., Пью Э.Н., младший (2007) Эволюция глаза позвоночных: опсины, фоторецепторы, сетчатка и глазная чашка. Nat Rev Neurosci 8: 960-76

2. Strauss O (2005) Пигментный эпителий сетчатки в зрительной функции.Physiol Rev 85: 845-81

3. Бок Д. (1993) Пигментный эпителий сетчатки: универсальный партнер в зрении. J Cell Sci Suppl 17: 189-95

4. Steinberg RH (1985) Взаимодействие между пигментным эпителием сетчатки и нервной сетчаткой. Док офтальмол 60: 327-46

5. Sparrow JR, Hicks D, Hamel CP (2010) Пигментный эпителий сетчатки в здоровье и болезни. Курр Мол Мед 10: 802-23

6. Марморштейн А.Д., Финнеманн С.К., Бонилья В.Л., Родригес-Булан Э. (1998) Морфогенез пигментного эпителия сетчатки: к пониманию дегенеративных заболеваний сетчатки.Ann N Y Acad Sci 857: 1-12

7. Rizzolo LJ (1997) Полярность и развитие внешнего гемато-ретинального барьера. Histol Histopathol 12: 1057-67

8. Fessler F (1920) Zur Entwicklungsmechanik des Auges. Арка Энтв Механ 46: 169-201

9. McCaffery P, Lee, M., Wagner, M. E., Sladek, N. E., DrŠger, U. C. (1992) Асимметричный синтез ретиноевой кислоты в дорсовентральной оси сетчатки. Развитие 115: 371-382

10. Mendelsohn C, Ruberte, E., Le Meur, M., Morris-Kay, G., Chambon, P. (1991) Анализ развития промотора RAR-b2, индуцируемого ретиноевой кислотой, у трансгенных животных. Развитие 113: 723-734.

11. Gonzalez-Fernandez F, Healy JI (1990) Ранняя экспрессия гена интерфоторецепторного ретинол-связывающего белка во время дифференцировки фоторецепторов предполагает критическую роль межфоторецепторного матрикса в развитии сетчатки. J Cell Biol 111: 2775-84

12. Холлифилд Дж. Г. (1999) Гиалуронан и функциональная организация межфоторецепторной матрицы.Инвест офтальмол Vis Sci 40: 2767-9

13. Pepperberg DR, Okajima TL, Wiggert B, Ripps H, Crouch RK, Chader GJ (1993) Интерфоторецепторный ретиноид-связывающий белок (IRBP). Молекулярная биология и физиологическая роль в зрительном цикле родопсина. Мол нейробиол 7: 61-85

14. Uehara F, Matthes MT, Yasumura D, LaVail MM (1990) Вызванные светом изменения в матрице интерфоторецепторов. Наука 248: 1633-6

15. Гаймер Р., Лютерт П., Берд А. (1999) Изменения мембраны Бруха и связанных структур с возрастом.Prog Retin Eye Res 18: 59-90

16. Битти С., Кох Х, Фил М., Хенсон Д., Боултон М. (2000) Роль окислительного стресса в патогенезе возрастной дегенерации желтого пятна. Surv Ophthalmol 45: 115-34

17. Битти С., Бултон М., Хенсон Д., Ко Х. Х., Мюррей И. Дж. (1999) Пигмент желтого пятна и возрастная дегенерация желтого пятна. Br J Ophthalmol 83: 867-77

18. Winkler BS, Boulton ME, Gottsch JD, Sternberg P (1999) Окислительное повреждение и возрастная дегенерация желтого пятна. Мол Виса 5:32

19.Alm A, Bill A (1970) Кровоток и извлечение кислорода в сосудистой оболочке при нормальном и высоком внутриглазном давлении. Acta Physiol Scand 80: 19-28

20. Алм А., Билл А. (1972) Подача кислорода к сетчатке. I. Влияние изменений внутриглазного и артериального кровяного давления, а также артериального P O 2 и P CO2 на напряжение кислорода в стекловидном теле кошки. Acta Physiol Scand 84: 261-74

21. Альм А., Билл А. (1972) Подача кислорода к сетчатке. II. Влияние высокого внутриглазного давления и повышенного давления углекислого газа в артериях на увеальный кровоток и кровоток в сетчатке глаза у кошек.Исследование с радиоактивно меченными микросферами, включая определение потока в головном мозге и некоторых других тканях. Acta Physiol Scand 84: 306-19

22. Alm A, Bill A (1973) кровоток в глазном и зрительном нерве при нормальном и повышенном внутриглазном давлении у обезьян (Macaca irus): исследование с радиоактивно мечеными микросферами, включая определение потока в головном мозге и некоторых других тканях. Exp Eye Res 15: 15-29

23. Auker CR, Parver LM, Doyle T, Carpenter DO (1982) Хориоидальный кровоток.I. Температура тканей глаза как мера потока. Arch Ophthalmol 100: 1323-6

24. Parver LM (1991) Температурно-модулирующее действие хориоидального кровотока. Глаз (Lond) 5 (Pt 2): 181-5

25. Boulton M, Dayhaw-Barker, P. (2001) Роль пигментного эпителия сетчатки: топографические вариации и изменения старения. Глаз 15: 384-389

26. Boulton M (1991) Старение пигментного эпителия сетчатки. В: Осборн Н.Н., Чейдер Г.Дж. (ред.) Прогресс в исследованиях сетчатки глаза. Pergamon Press, Оксфорд, Нью-Йорк, стр.125-51

27. Schutt F, Davies S, Kopitz J, Holz FG, Boulton ME (2000) Фотоповреждение клеток RPE человека A2-E, ретиноидным компонентом липофусцина. Инвест офтальмол Vis Sci 41: 2303-8

28. Бен-Шабат С., Округ Калифорния, Фоллмер Х. Р., Итагаки Ю., Фишкин Н., Наканиши К., Воробей Дж. Р. (2002) Биосинтетические исследования A2E, основного флуорофора липофусцина пигментного эпителия сетчатки. J Biol Chem 277: 7183-90

29. Delori FC, Goger DG, Dorey CK (2001) Возрастное накопление и пространственное распределение липофусцина в RPE здоровых субъектов.Инвест офтальмол Vis Sci 42: 1855-66

30. Миллер С.С., Стейнберг Р.Х. (1977) Активный транспорт ионов через пигментный эпителий сетчатки лягушки. Exp Eye Res 25: 235-48

31. Миллер С.С., Стейнберг Р.Х. (1977) Пассивные ионные свойства пигментного эпителия сетчатки лягушки. J Membr Biol 36: 337-72

32. Ban Y, Rizzolo LJ (2000) Регулирование переносчиков глюкозы во время развития пигментного эпителия сетчатки. Исследование мозга, разработчик, исследование мозга, 121: 89-95

33. Sugasawa K, Deguchi J, Okami T, Yamamoto A, Omori K, Uyama M, Tashiro Y (1994) Иммуноцитохимический анализ распределения Na, K-ATPase и GLUT1, рецепторов инсулина и трансферрина в развивающихся пигментных эпителиальных клетках сетчатки .Функция сотовой структуры 19: 21-8

34. Базан Н.Г., Гордон В.С., Родригес де Турко, Э. Б. (1992) Поглощение и метаболизм докозагексаеновой кислоты в фоторецепторах: сохранение сетчатки посредством эффективного процесса рециклинга пигментных эпителиальных клеток сетчатки. Нейробиология незаменимых жирных кислот: 295-306

35. Базан Н.Г., Родригес де Турко Э.Б., Гордон В.К. (1994) Поставка докозагексаеновой кислоты в сетчатку и ее сохранение в фоторецепторных клетках за счет активной рециркуляции пигментного эпителия сетчатки.World Rev Nutr Diet 75: 120-3

36. Хьюз Б.А., Галлемор Р.П., Миллер С.С. (1998) Транспортные механизмы в пигментном эпителии сетчатки. В: Marmor MF, Wolfensberger TJ (eds) Пигментный эпителий сетчатки. Oxford University Press, New York, Oxford, pp. 103-134

37. Hamann S (2002) Молекулярные механизмы транспорта воды в глазу. Int Rev Cytol 215: 395-431

38. Адлер А.Дж., Саутвик Р.Э. (1992) Распределение глюкозы и лактата в матрице интерфоторецепторов. Ophthalmic Res 24: 243-52

39.Edelman JL, Miller SS (1991) Адреналин стимулирует абсорбцию жидкости через пигментный эпителий сетчатки крупного рогатого скота. Инвест офтальмол Vis Sci 32: 3033-40

40. Hughes BA, Miller SS, Machen TE (1984) Влияние циклического АМФ на абсорбцию жидкости и перенос ионов через пигментный эпителий сетчатки лягушки. Измерения в разомкнутом состоянии. J Gen Physiol 83: 875-99

41. Tsuboi S (1987) Измерение объемного потока и гидравлической проводимости через изолированный пигментный эпителий сетчатки глаза собаки.Инвест офтальмол Vis Sci 28: 1776-82

42. Hughes BA, Takahira M (1996) Внутреннее выпрямление токов K ⁺ в изолированных клетках пигментного эпителия сетчатки человека. Инвест офтальмол Vis Sci 37: 1125-39

43. Ху Дж. Г., Галлемор Р. П., Бок Д., Ли А. Ю., Фрамбах Д. А. (1994) Локализация NaK-АТФазы на культивируемом пигментном эпителии сетчатки человека. Инвест офтальмол Vis Sci 35: 3582-8

44. Frambach DA, Roy CE, Valentine JL, Weiter JJ (1989) На преждевременную адгезию сетчатки влияют фуросемид и уабаин.Curr Eye Res 8: 553-6

45. Миллер С.С., Эдельман Дж. Л. (1990) Активные пути переноса ионов в пигментном эпителии сетчатки крупного рогатого скота. J Physiol 424: 283-300

46. Джозеф Д.П., Миллер С.С. (1991) Механизмы транспорта ионов апикальной и базальной мембран в пигментном эпителии сетчатки крупного рогатого скота. J Physiol 435: 439-63

47. La Cour M (1992) Cl- транспорт в пигментном эпителии сетчатки лягушки. Exp Eye Res 54: 921-31

48. Видерхольт М., Задунайский Ю.А. (1984) Снижение внутриклеточной хлоридной активности фуросемидом в пигментном эпителии сетчатки лягушки.Curr Eye Res 3: 673-5

49. Bosl MR, Stein V, Hubner C, Zdebik AA, Jordt SE, Mukhopadhyay AK, Davidoff MS, Holstein AF, Jentsch TJ (2001) Мужские половые клетки и фоторецепторы, оба зависят от тесных межклеточных взаимодействий, дегенерируют на ClC -2 Обрыв канала Cl (-). Embo J 20: 1289-99

50. Blaug S, Quinn R, Quong J, Jalickee S, Miller SS (2003) Функция пигментного эпителия сетчатки: роль CFTR? Док офтальмол 106: 43-50

51. Weng TX, Godley BF, Jin GF, Mangini NJ, Kennedy BG, Yu AS, Wills NK (2002) Окислительная и антиоксидантная модуляция хлоридных каналов, экспрессируемых в пигментном эпителии сетчатки человека.Am J Physiol Cell Physiol 283: C839-49

52. Hartzell HC, Qu Z, Yu K, Xiao Q, Chien LT (2008) Молекулярная физиология бестрофинов: многофункциональные мембранные белки, связанные с лучшими заболеваниями и другими ретинопатиями. Physiol Rev 88: 639-72

53. Hamann S, Kiilgard JF, la Cour M, Prause JU, Zeuthen T (2003) Котранспорт H ⁺ , лактата и h3O в пигментных эпителиальных клетках сетчатки свиней. Exp Eye Res 76: 1-12

54. Keller SK, Jentsch TJ, Janicke I, Wiederholt M (1988) Регулирование внутриклеточного pH в культивируемых бычьих клетках пигментного эпителия сетчатки.Арка Пфлюгерс 411: 47-52

55. Keller SK, Jentsch TJ, Koch M, Wiederholt M (1986) Взаимодействие pH и проводимости K ⁺ в культивируемых клетках пигментного эпителия сетчатки крупного рогатого скота. Am J Physiol 250: C124-37

56. la Cour M (1991) Гомеостаз pH в сетчатке лягушки: роль ко-транспорта Na ⁺ : HCO3- в пигментном эпителии сетчатки. Acta Ophthalmol (Копен) 69: 496-504

57. la Cour M, Lin H, Kenyon E, Miller SS (1994) Транспорт лактата в свежевыделенном фетальном пигментном эпителии сетчатки человека.Инвест офтальмол Vis Sci 35: 434-42

58. Bialek S, Miller SS (1994) K ⁺ и механизмы транспорта Cl- в пигментном эпителии крупного рогатого скота, которые могут модулировать объем и состав субретинального пространства. J Physiol 475: 401-17

59. Ботчкин Л.М., Мэтьюз Г. (1993) Хлоридный ток, активируемый набуханием в клетках пигментного эпителия сетчатки. Am J Physiol 265: C1037-45

60. Hamann S, la Cour M, Lui GM, Bundgaard M, Zeuthen T (2000) Транспорт протонов и лактата в культивируемых клетках пигментного эпителия сетчатки плода человека.Пфлюгерс Арка 440: 84-92

61. Вольфенсбергер Т.Дж., Дмитриев А.В., Говардовский В.И. (1999) Ингибирование мембраносвязанной карбоангидразы снижает субретинальный pH и объем. Док офтальмол 97: 261-71

62. Linsenmeier RA, Padnick-Silver L (2000) Метаболическая зависимость фоторецепторов от сосудистой оболочки нормальной и отслоенной сетчатки. Инвест офтальмол Vis Sci 41: 3117-23

63. Marmor MF (1990) Контроль субретинальной жидкости: экспериментальные и клинические исследования. Глаз 4: 340-344

64.Hamann S, Zeuthen T, La Cour M, Nagelhus EA, Ottersen OP, Agre P, Nielsen S (1998) Аквапорины в сложных тканях: распределение аквапоринов 1-5 в глазу человека и крысы. Am J Physiol 274: C1332-45

65. Stamer WD, Bok D, Hu J, Jaffe GJ, McKay BS (2003) Каналы аквапорина-1 в пигментном эпителии сетчатки человека: роль в трансэпителиальном движении воды. Инвест офтальмол Vis Sci 44: 2803-8

66. Steinberg RH, Linsenmeier RA, Griff ER (1983) Три вызванных светом реакции пигментного эпителия сетчатки.Видение Res 23: 1315-23

67. Бейлор Д. (1996) Как фотоны запускают зрение. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 560-5

68. la Cour M (1985) Пигментный эпителий сетчатки контролирует активность калия в субретинальном пространстве. Acta Ophthalmol Suppl 173: 9-10

69. Shimura M, Yuan Y, Chang JT, Zhang S, Campochiaro PA, Zack DJ, Hughes BA (2001) Свойства экспрессии и проникновения K ( ⁺ ) канала Kir7.1 в пигментном эпителии сетчатки. J Physiol 531: 329-46

70.Hughes BA, Takahira M (1998) АТФ-зависимая регуляция внутреннего выпрямляющего тока K ⁺ в пигментных эпителиальных клетках сетчатки крупного рогатого скота. Am J Physiol 275: C1372-83

71. la Cour M, Lund-Andersen H, Zeuthen T (1986) Транспорт калия пигментного эпителия сетчатки лягушки: ауторегуляция активности калия в субретинальном пространстве. J Physiol 375: 461-79

72. Huang B, Karwoski CJ (1992) Вызванное светом расширение объема субретинального пространства в сетчатке лягушки.J Neurosci 12: 4243-52

73. Kenyon E, Maminishkis A, Joseph DP, Miller SS (1997) Апикальные и базолатеральные мембранные механизмы, которые регулируют pHi в пигментном эпителии сетчатки крупного рогатого скота. Am J Physiol 273: C456-72

74. Lin H, Kenyon E, Miller SS (1992) Na-зависимые регуляторные механизмы pHi в нативном пигментном эпителии сетчатки человека. Инвест офтальмол Vis Sci 33: 3528-38

75. Lin H, Miller SS (1991) регуляция pHi в пигментном эпителии сетчатки лягушки: два механизма апикальной мембраны.Am J Physiol 261: C132-42

76. Окада Т., Эрнст О.П., Пальчевски К., Хофманн К.П. (2001) Активация родопсина: новые идеи структурных и биохимических исследований. Trends Biochem Sci 26: 318-24

77. Hofmann KP (1999) Сигнальные состояния фотоактивированного родопсина. Novartis Found Symp 224: 158-75; обсуждение 175-80

78. Бейлор Д.А., Бернс М.Э. (1998) Контроль активности родопсина в зрении. Глаз 12 (Pt 3b): 521-5

79. Лэмб Т.Д., Пью Е.Н., младший (2004) Темная адаптация и ретиноидный цикл зрения.Prog Retin Eye Res 23: 307-80

80. Baehr W, Wu, S. M., Bird, A. C., Palczewski, K. (2003) Ретиноидный цикл и болезнь сетчатки. Vis Res 43: 2957-2958

81. Томпсон Д.А., Гал А. (2003) Метаболизм витамина А в пигментном эпителии сетчатки: гены, мутации и болезни. Prog Retin Eye Res 22: 683-703

82. Томпсон Д.А., Гал А (2003) Генетические дефекты метаболизма витамина А в пигментном эпителии сетчатки. Дев Офтальмол 37: 141-54

83. Xue L, Gollapalli DR, Maiti P, Jahng WJ, Rando RR (2004) Механизм переключения пальмитоилирования в регуляции зрительного цикла.Ячейка 117: 761-71

84. Jin M, Li S, Moghrabi WN, Sun H, Travis GH (2005) Rpe65 — это ретиноидная изомераза в пигментном эпителии сетчатки крупного рогатого скота. Ячейка 122: 449-59

85. Штраус О., Штумпфф Ф., Мерглер С., Винрих М., Видерхольт М. (1998) Королевский колледж хирургов Крыса: животная модель наследственной дегенерации сетчатки с еще неизвестным генетическим дефектом. Акта Анат (Базель) 162: 101-11

86. ЛаВейл М.М. (1976) Заражение диска внешнего сегмента стержня в связи с циклическим освещением.Исследование глаз 23: 277-80

87. ЛаВейл М.М. (1980) Циркадная природа отслаивания диска наружного сегмента палочек у крысы. Инвестируйте офтальмол Vis Sci 19: 407-11

88. LaVail MM (1983) Отшелушивание диска внешнего сегмента и фагоцитоз в наружной сетчатке. Trans Ophthalmol Soc U K 103 (Pt 4): 397-404

89. Кевани Б.М., Пальчевски К. (2010) Фагоцитоз фоторецепторов палочек и колбочек сетчатки. Физиология (Bethesda) 25: 8-15

90. Green CB, Besharse JC (2004) Циркадные часы сетчатки и контроль физиологии сетчатки.Журнал Биол Ритмз 19: 91-102

91. Besharse JC, Defoe DM (1998) Роль пигментного эпителия сетчатки в обороте мембраны фоторецепторов. В: Marmor MF, Wolfensberger TJ (eds) Пигментный эпителий сетчатки. Oxford University Press, Oxford, pp. 152-172

92. Besharse JC, Hollyfield JG (1979) Оборот внешних сегментов фоторецепторов мыши в постоянном свете и темноте. Инвестируйте офтальмол Vis Sci 18: 1019-24

93. Besharse JC, Hollyfield JG, Rayborn ME (1977) Наружные сегменты фоторецепторов: ускоренное обновление мембран в палочках после воздействия света.Наука 196: 536-8

94. Бобу С., Хикс Д. (2009) Регулирование фагоцитоза фоторецепторов сетчатки у дневных млекопитающих с помощью циркадных часов и окружающего освещения. Инвест офтальмол Vis Sci 50: 3495-502

95. Finnemann SC, Silverstein RL (2001) Дифференциальная роль интегрина CD36 и alphavbeta5 в фоторецепторном фагоцитозе пигментным эпителием сетчатки. J Exp Med 194: 1289-98

96. Ryeom SW, Sparrow JR, Silverstein RL (1996) CD36 участвует в фагоцитозе наружных сегментов палочек пигментным эпителием сетчатки.J Cell Sci 109 (Pt 2): 387-95

97. Finnemann SC, Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez-Boulan E (1997) Фагоцитоз наружных сегментов палочек пигментными эпителиальными клетками сетчатки требует интегрина альфа (v) бета5 для связывания, но не для интернализации. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 12932-7

98. Finnemann SC (2003) Передача сигналов киназы фокальной адгезии способствует фагоцитозу фоторецепторов, связанных с интегрином. Embo J 22: 4143-4154

99. Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE, Huang X, Sheppard D, Finnemann SC (2004) Потеря синхронизированного фагоцитоза сетчатки и возрастная слепота у мышей, лишенных {alpha} v {beta} 5 Integrin.J Exp Med 200: 1539-1545

100. D’Cruz PM, Yasumura D, Weir J, Matthes MT, Abderrahim H, LaVail MM, Vollrath D (2000) Мутация гена рецепторной тирозинкиназы Mertk у крыс с дистрофической сетчаткой RCS. Hum Mol Genet 9: 645-51

101. Гал А, Ли И, Томпсон Д.А., Вейр Дж., Орт У., Якобсон С.Г., Апфельштедт-Силла Э., Воллрат Д. (2000) Мутации в MERTK, человеческом ортологе гена дистрофии сетчатки крыс RCS, вызывают пигментный ретинит. Нат Генет 26: 270-1

102. Feng W, Yasumura D, Matthes MT, LaVail MM, Vollrath D (2002) Мертк запускает захват внешних сегментов фоторецептора во время фагоцитоза культивированными клетками пигментного эпителия сетчатки.J Biol Chem 277: 17016-22

103. Teirstein PS, Goldman AI, O’Brien PJ (1980) Доказательства как местного, так и центрального регулирования отслаивания диска внешнего сегмента палочек крысы. Инвест офтальмол Vis Sci 19: 1268-73

104. Маллаварапу М., Финнеманн С.К. (2010) Нейронная сетчатка и независимая от MerTK апикальная полярность рецепторов интегрина alphavbeta5 в пигментном эпителии сетчатки. Adv Exp Med Biol 664: 123-31

105. Nandrot EF, Chang Y, Finnemann SC (2008) Рецепторы интегрина Alphavbeta5 на апикальной поверхности RPE: один рецептор, две функции.Adv Exp Med Biol 613: 369-75

106. Nandrot EF, Anand M, Almeida D, Atabai K, Sheppard D, Finnemann SC (2007) Существенная роль MFG-E8 как лиганда для интегрина alphavbeta5 в дневном фагоцитозе сетчатки. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 12005-10

107. Карл М.О., Крегер В., Виммерс С., Миленкович В.М., Валтинк М., Энгельманн К., Штраус О. (2008) Эндогенный газ6 и активация канала Са ²⁺ модулируют фагоцитоз пигментным эпителием сетчатки. Сотовый сигнал 20: 1159-68

108.Caberoy NB, Zhou Y, Li W (2010) Tubby и tubby-like белок 1 являются новыми лигандами MerTK для фагоцитоза. EMBO J 29: 3898-910

109. Cayouette M, Smith SB, Becerra SP, Gravel C (1999) Фактор, полученный из пигментного эпителия, задерживает гибель фоторецепторов в мышиных моделях унаследованных дегенераций сетчатки. Нейробиол Дис 6: 523-32

110. Огата Н., Ван Л., Джо Н., Томбран-Тинк Дж., Такахаши К., Мразек Д., Мацумура М. (2001) Фактор, полученный из пигментного эпителия, как нейропротекторное средство против ишемического повреждения сетчатки.Curr Eye Res 22: 245-52

111. Becerra SP, Fariss RN, Wu YQ, Montuenga LM, Wong P, Pfeffer BA (2004) Фактор, полученный из пигментного эпителия, в пигментном эпителии сетчатки обезьяны и матрице интерфоторецепторов: апикальная секреция и распределение. Exp Eye Res 78: 223-34

112. Витмер А.Н., Вренсен Г.Ф., Ван Ноорден С.Дж., Шлингеманн Р.О. (2003) Факторы роста эндотелия сосудов и ангиогенез при заболеваниях глаз. Prog Retin Eye Res 22: 1-29

113. Wimmers S, Karl MO, Strauss O (2007) Ионные каналы в RPE.Prog Retin Eye Res 26: 263-301

114. Rosenthal R, Strauss O (2002) Ca ²⁺ -каналов в RPE. Adv Exp Med Biol 514: 225-35

115. Catterall WA (2000) Структура и регулирование потенциалзависимых каналов Ca ²⁺ . Annu Rev Cell Dev Biol 16: 521-55

116. Striessnig J (1999) Фармакология, структура и функция сердечных Са каналов L-типа (2 ⁺ ). Cell Physiol Biochem 9: 242-69

117. Rosenthal R, Thieme H, Strauss O (2001) Рецептор 2 фактора роста фибробластов (FGFR2) в нейронах головного мозга и пигментные эпителиальные клетки сетчатки действуют посредством стимуляции нейроэндокринных каналов L-типа (Ca (v) 1.3). Faseb J 15: 970-7

118. Strauss O, Mergler S, Wiederholt M (1997) Регулирование кальциевых каналов L-типа протеинтирозинкиназой и протеинкиназой C в культивируемых клетках пигментного эпителия сетчатки крысы и человека. Faseb J 11: 859-67

119. Strauss O, Buss F, Rosenthal R, Fischer D, Mergler S, Stumpff F, Thieme H (2000) Активация нейроэндокринных каналов L-типа (субъединицы alpha1D) в пигментных эпителиальных клетках сетчатки и нейронах головного мозга с помощью pp60 (c- SRC). Biochem Biophys Res Commun 270: 806-10

120.Cordeiro S, Seyler S, Stindl J, Milenkovic VM, Strauss O Термочувствительные каналы TRPV в пигментных эпителиальных клетках сетчатки: регуляция секреции VEGF-A. Инвест офтальмол Vis Sci 51: 6001-8

121. Ishida K, Panjwani N, Cao Z, Streilein JW (2003) Участие пигментного эпителия в иммунной защите глаз. 3. Эпителий, культивируемый из радужки, цилиарного тела и сетчатки, подавляет активацию Т-клеток за счет частично неперекрывающихся механизмов. Ocul Immunol Inflamm 11: 91-105

122. Streilein JW, Ma N, Wenkel H, Ng TF, Zamiri P (2002) Иммунобиология и привилегия нейрональных трансплантатов сетчатки и пигментного эпителия.Vision Res 42: 487-95

123. Wenkel H, Streilein JW (2000) Доказательства того, что пигментный эпителий сетчатки функционирует как иммунная привилегированная ткань. Инвест офтальмол Vis Sci 41: 3467-73

124. Relvas LJ, Bouffioux C, Marcet B, Communi D, Makhoul M, Horckmans M, Blero D, Bruyns C, Caspers L, Boeynaems JM, Willermain F (2009) Производство внеклеточных нуклеотидов и интерлейкина-8 клетками ARPE: потенциал роль сигналов опасности в активации гемато-ретинального барьера. Инвест офтальмол Vis Sci 50: 1241-6

125.Kim YH, He S, Kase S, Kitamura M, Ryan SJ, Hinton DR (2009) Регулируемая секреция фактора комплемента H с помощью RPE и его роль в миграции RPE. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 247: 651-9

126. Chen M, Forrester JV, Xu H (2007) Синтез фактора комплемента H пигментными эпителиальными клетками сетчатки подавляется окисленными внешними сегментами фоторецепторов. Опыт Глаза Рес 84: 635-45

127. Austin BA, Liu B, Li Z, Nussenblatt RB (2009) Биологически активные фрагменты фибронектина стимулируют высвобождение MCP-1 и катаболических цитокинов из пигментного эпителия сетчатки мыши.Инвест офтальмол Vis Sci 50: 2896-902

128. Jorgensen A, Wiencke AK, la Cour M, Kaestel CG, Madsen HO, Hamann S, Lui GM, Scherfig E, Prause JU, Svejgaard A, Odum N, Nissen MH, Ropke C (1998) Эпителиальная клетка пигмента сетчатки человека -индуцированный апоптоз в активированных Т-клетках. Инвест офтальмол Vis Sci 39: 1590-9

129. Liversidge J, McKay D, Mullen G, Forrester JV (1993) Пигментные эпителиальные клетки сетчатки модулируют функцию лимфоцитов на гемато-сетчатом барьере посредством аутокринного PGE2 и мембраносвязанных механизмов.Клеточный иммунол 149: 315-30

130. Киндзельский А.Л., Элнер В.М., Элнер С.Г., Янг Д., Хьюз Б.А., Петти HR (2004) Толл-подобный рецептор 4 (TLR4) пигментных эпителиальных клеток сетчатки участвует в трансмембранной передаче сигналов в ответ на внешние сегменты фоторецепторов. J Gen Physiol 124: 139-49

131. Oh H, Takagi H, Takagi C, Suzuma K, Otani A, Ishida K, Matsumura M, Ogura Y, Honda Y (1999) Потенциальная ангиогенная роль макрофагов в формировании хориоидальных неоваскулярных мембран. Инвестируйте офтальмол Vis Sci 40: 1891-8.

132. Томпсон Д.А. и Гал А. (2003) Метаболизм витамина А в пигментном эпителии сетчатки: гены, мутации и болезни. Prog Retin Eye Res 22: 683-703

133. Strauss, O (2009) Роль пигментного эпителия сетчатки в зрительных функциях. Офтальмолог 106: 299-304

Автор

Олаф Штраус — берлинец, получивший образование в Берлине до получения докторской степени по зоологии и физиологии в 1990 году и хабилитации в 1999 году в Берлинском свободном университете.После пяти лет работы профессором экспериментальной офтальмологии в UKE, Гамбург, он занял должность специалиста по экспериментальной офтальмологии в университетской клинике Регенсбурга. В настоящее время он профессор экспериментальной офтальмологии в Регенсбургском университете. Его исследовательские интересы всегда были связаны с пониманием функции пигментного эпителия сетчатки. Представляют интерес два основных направления исследований РПЭ: секреция и фагоцитоз. Его работа была сосредоточена на Са2 + -зависимой регуляции ионными каналами и цитозольными запасами Са2 +.Недавняя работа сосредоточена на взаимодействии бестрофина-1 с потенциал-зависимыми Са2 + каналами при желточно-образной макулярной дистрофии Беста и на системном влиянии ренин-ангиотензиновой системы на функцию сетчатки. Электронный адрес: [email protected]

Спектр фототоксического действия на модели пигментного эпителия сетчатки, связанной с возрастной дегенерацией желтого пятна в условиях нормализованного солнечного света

Abstract

Известно, что среди выявленных факторов риска возрастной дегенерации желтого пятна солнечный свет вызывает кумулятивное повреждение сетчатки.Фоточувствительное производное зрительного пигмента, N -ретинилиден- N -ретинилэтаноламин (A2E), может быть вовлечено в эту фототоксичность. Инкриминируется высокоэнергетический видимый свет между 380 нм и 500 нм (синий свет). Наша цель состояла в том, чтобы определить наиболее токсичные длины волн в сине-зеленом диапазоне на модели болезни in vitro . Первичные культуры клеток пигментного эпителия сетчатки свиней инкубировали в течение 6 часов с различными концентрациями A2E и экспонировали в течение 18 часов при освещении полосами 10 нм с центром от 380 до 520 нм с шагом 10 нм.Освещенность была нормализована по отношению к естественному солнечному свету, достигающему сетчатки. Через шесть часов после воздействия света жизнеспособность клеток, некроз и апоптоз оценивали с помощью анализа Apotox-Glo Triplex ™. Клетки пигментного эпителия сетчатки, инкубированные с A2E, отображали флуоресцентные тельца в цитоплазме. Их спектры поглощения и излучения были аналогичны спектрам А2Е. Воздействие полосами освещения 10 нм вызывало потерю жизнеспособности клеток с дозовой зависимостью от концентраций А2Е.Независимо от концентрации A2E потеря жизнеспособности клеток была максимальной для длин волн от 415 до 455 нм. Снижение жизнеспособности клеток коррелировало с увеличением апоптоза клеток, на что указывает активность каспазы-3/7 в том же спектральном диапазоне. Некроза, вызванного светом, не измеряли по сравнению с контрольными клетками, находящимися в темноте. Наши результаты определили точный спектр световой токсичности сетчатки в условиях физиологического облучения на модели in vitro возрастной дегенерации желтого пятна.Удивительно, но узкая полоса пропускания синего света создает наибольший фототоксический риск для клеток пигментного эпителия сетчатки. Этот фототоксичный спектр может быть выгодно оценен при создании селективных фотозащитных офтальмологических фильтров без нарушения основных зрительных и невизуальных функций глаза.

Образец цитирования: Arnault E, Barrau C, Nanteau C, Gondouin P, Bigot K, Viénot F, et al. (2013) Спектр фототоксического действия на модели пигментного эпителия сетчатки, связанной с возрастной дегенерацией желтого пятна, в условиях нормализованного солнечного света.PLoS ONE 8 (8): e71398. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071398

Редактор: Альфред Левин, Университет Флориды, Соединенные Штаты Америки

Поступило: 4 марта 2013 г .; Принята к печати: 28 июня 2013 г .; Опубликован: 23 августа 2013 г.

Авторские права: © 2013 Arnault et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта исследовательская программа получила французские государственные субсидии от OSEO (проект DESCARTES), а также была поддержана INSERM, Université Pierre et Marie Curie (Париж VI), CNRS, Ophtalmologique Fondation A. de Rothschild (Париж), Fédération des Aveugles de France, город Париж, Региональный совет Иль-де-Франс и ESSILOR International. Эта работа, выполненная в рамках LABEX LIFESENSES [ссылка ANR-10-LABX-65], также была поддержана французскими государственными фондами, управляемыми ANR в рамках программы Investissements d’Avenir под номером ANR-11-IDEX-0004-02.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы имеют следующие интересы: 3 поданных патента («Оптическое устройство», PCT / IB2012 / 057013, PCT / IB2012 / 057014 и PCT / IB2012 / 057015). CB, TV и DCT используются Essilor International (Шарантон-ле-Пон, Франция), одним из спонсоров этого исследования. Нет никаких других патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно было бы декларировать.Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.

Введение

Возрастная дегенерация желтого пятна (ARMD) является одной из основных причин слепоты в промышленно развитых странах и, по оценкам, является причиной 22,9% случаев слепоты и 54,4% нарушений зрения среди белого населения Америки [ 1]. В настоящее время 9,1 миллиона американцев старше 50 лет с большой вероятностью страдают ранним ВМЗ [2].Ожидается, что к 2050 году это число удвоится и достигнет 17,8 миллиона [3]. Тяжелая потеря зрения из-за ARMD затрагивает не менее 12% населения США и Европы старше 80 лет [2], [4], [5].

Возраст, курение, цвет кожи, генетические факторы и недостаточность пищевых антиоксидантов были определены как факторы риска при ВМД [6]. Хотя значение света остается спорным, несколько исследований указывают на то, что воздействие света является фактором патогенеза ВМД [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13].Например, исследование EUREYE обнаружило значительную связь между воздействием синего света и неоваскулярным ARMD у лиц с самым низким уровнем антиоксидантов [11]. Другое исследование, проведенное на 838 водниках из Чесапикского залива, показало, что пациенты с поздней стадией ВМД значительно чаще подвергались воздействию синего или видимого света за предыдущие 20 лет [8]. Наконец, недавний анализ эпидемиологической литературы, касающийся связи между ARMD и воздействием солнечного света, показал, что люди, подвергающиеся большему воздействию солнечного света, подвергаются значительно повышенному риску ARMD [14].

Ранние стадии ARMD обычно связаны с образованием характерных отложений под пигментным эпителием сетчатки (RPE) и мембраной Бруха, называемых друзами [15], и с накоплением липофусцина в клетках RPE. Липофусцин накапливается с возрастом в лизозомах как побочный продукт зрительного цикла и неполной деградации фагоцитированных окисленных внешних сегментов фоторецепторов [16], [17], [18]. Основным хромофором липофусцина является A2E ( N -ретинилиден- N -ретинилэтаноламин), фотосенсибилизатор, вызывающий фотодинамические повреждения [19], [20].Считается, что специфическая токсичность коротких волн для сетчатки связана с присутствием этой внутриклеточной молекулы [21].

Исследования, проведенные на животных и клеточных моделях, смогли продемонстрировать токсичность света и, в частности, синего спектрального диапазона на РПЭ и фоторецепторных клетках. Например, эксперименты in vivo показали, что фотохимические повреждения демонстрируют более низкие пороги дозы в УФ и синем диапазоне, чем для зеленого или красного света на сетчатке [22] обезьяны [23], [24], крысы [25]. , [26], [27] и кролик [28], [29], [30], [31], [32].Затем эти световые повреждения моделировали на первичных или иммортализованных клетках РПЭ, нагруженных либо окисленными внешними сегментами фоторецепторов [33], очищенным липофусцином [34], либо синтезированным A2E [35], [36], [37], [38], [39]. ]. Более высокая токсичность синего света была подтверждена путем воздействия на клетки РПЭ человека, нагруженные липофусцином, в течение 48 часов сине-зеленым светом (390–550 нм, 2,8 мВт / см ² ) по сравнению с желто-красным светом (550–800 нм, 2,8 мВт / см ² ) [34]. Точно так же воздействие синего света (480 ± 20 нм, 75 мВт / мм ² ) вызывало большую гибель клеток на иммортализованных клетках RPE, нагруженных A2E (линия клеток ARPE-19), чем на зеленый свет (545 ± 15 нм, 200 мВт / мм). мм ² ) [36].Гибель клеток, вызванная синим светом, опосредована апоптотическими процессами, включающими активацию каспазы-3 и p-53 [40], [41]. Однако в этих исследованиях освещенность не была приведена к физиологическим условиям, что означает (i) отсутствие калибровки по спектру солнечного света и (ii) отсутствие учета фильтрации среды глаза. Кроме того, не было проведено ни одного теста для точного определения наиболее токсичных длин волн во всем синем диапазоне.

В настоящем исследовании нашей целью было, во-первых, рассчитать солнечное излучение, достигающее сетчатки, а во-вторых, оценить световую токсичность на клетках РПЭ, нагруженных A2E, световой токсичности полос освещения 10 нм при освещенности, нормированной на рассчитанную солнечную освещенность сетчатки.Таким образом, мы определили наиболее токсичные длины волн в синем диапазоне, которые можно было бы точно удалить, чтобы наилучшим образом сохранить цветовое зрение и невизуальные функции.

Результаты

Освещенность

Для моделирования воздействия солнечного света на сетчатку, освещенность для каждого источника света 10 нм была откалибрована в соответствии с нормализованным спектром, полученным путем применения естественных окулярных фильтров (рис. 1A и 1B) к стандартному солнечному спектру (ASTM G173-03) (см. Материалы и методы, рис. 1С).Радиометрические расчеты основывались на двух основных параметрах: (i) энергетической яркости источника света и (ii) коэффициенте пропускания окулярной среды, адаптированном из [42] и в соответствии с недавними эталонными данными о пропускании из CIE 203: 2012. Измеренные значения освещенности на уровне пластины показаны на рис. 1D.

Рис. 1. Солнечное излучение, достигающее сетчатки.

A. Модель глаза / источника света адаптирована из [61]. Источник света описывается его энергетической яркостью L _{e, λ, источником} (λ) (Вт / ср / м ² ), измеренной в направлении зрачка и его излучающей поверхностью S _{источник} (м ² ).Предполагается, что источник мал по сравнению с расстоянием u (м) между источником и роговицей. Предполагается, что плоскость роговицы, плоскость зрачка и узловые плоскости накладываются друг на друга. Поверхность сетчатки S _{сетчатки} , освещенная источником света, пропорциональна поверхности источника S _{источника} . B. Коэффициент пропускания сетчатки в процентах, рассчитанный по [61]. C. ASTM G173-03 спектральная освещенность солнечного света (черная кривая, левая ось) и солнечное излучение, достигающее сетчатки (серая кривая, правая ось).Энергетическое излучение, достигающее сетчатки, было рассчитано путем применения фильтрации окулярной среды к указанному солнечному спектру. D. Облучение на уровне планшета. Условия светового воздействия были получены путем применения коэффициента умножения к рассчитанной освещенности сетчатки. Значения выражены в виде среднего ± s.e.m (n = от 4 до 6).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071398.g001

Светодиодное волокнистое осветительное устройство с компьютерным мониторингом было специально разработано для применения нормализованных условий освещения (рис.2А и Б). Генератор света состоял из 14 узких полос освещения, равномерно распределенных в сине-зеленом диапазоне с шагом 10 нм, при этом первая полоса была сосредоточена на 390 нм и доходила до 520 нм. Дополнительная полоса была установлена ​​на 630 нм.

Рисунок 2. Светоизлучающее устройство.

A. Светодиодное волокнистое осветительное устройство состоит из двух оптических блоков и программного управления. Блок 1 генерирует пятнадцать каналов освещения шириной 10 нм. Четырнадцать полос равномерно распределены в сине-зеленом диапазоне с шагом 10 нм, при этом первая полоса центрируется на 390 нм и достигает 520 нм.Дополнительная полоса установлена ​​на 630 нм в красном спектральном диапазоне. Энергетическая освещенность, доставляемая каждым каналом освещения, контролируется компьютером. Блок 2 расположен в инкубаторе клеток и обеспечивает равномерное освещение клеток. Два оптических блока связаны пятью независимыми системами пучков волокон, обеспечивающими свет для пяти 16-луночных подразделений 96-луночного планшета. B. Типичное освещение 96-луночного планшета. Пять 16-луночных подразделений одновременно освещаются различными световыми полосами, в то время как 16-луночные подразделения сохраняются в темноте.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071398.g002

Характеристика клеток РПЭ, нагруженных A2E

Чтобы выяснить, могут ли свиные клетки RPE использоваться в качестве клеточной модели старения RPE, мы сначала исследуем их способность накапливать A2E во время инкубации A2E. Проглатывание A2E клетками RPE предполагалось появлением многочисленных флуоресцентных точек, видимых под микроскопом в цитоплазме (рис. 3A). Увеличение количества флуоресцентных везикул внутри клеток RPE, по-видимому, зависит от дозы от внеклеточных концентраций A2E (рис.3Б). Чтобы исследовать, обнаруживают ли эти аутофлуоресцентные тельца присутствие внутриклеточного A2E, был проведен спектр поглощения инкубированных A2E клеток RPE. Инкубация A2E при 40 мкМ генерировала пик поглощения при 440 нм (фиг. 4A), который отсутствовал в необработанных клетках RPE. Вычитание спектров клеток, нагруженных А2Е, и необработанных клеток дало два пика поглощения при 335 и 440 нм, как наблюдалось со свободным А2Е, растворенным в модифицированной среде DMEM или в чистом этаноле (фиг. 4B). Эти наблюдения согласуются с ранее опубликованными спектрами поглощения для свободного A2E [37].После возбуждения светом при 440 нм нагруженные A2E клетки проявляли спектр излучения с максимумом при 620 нм (фиг. 4C), близким к максимуму эмиссии A2E при 640 нм (фиг. 4D) в DMEM или в чистом этаноле. Для дальнейшего подтверждения интернализации A2E клетками RPE, A2E очищали из культивируемых клеток RPE и количественно определяли с помощью UPLC, что позволило выявить A2E до 10 пг (фиг. 4E). В наших условиях концентрация A2E в клетках RPE показывала линейную корреляцию с концентрациями A2E, добавленными в культуральную среду (r ² = 0.9955, n = 4). Необработанные клетки RPE показали очень низкое эндогенное содержание A2E (0,032 ± 0,006 нг / 10 ⁵ клеток). Это наблюдение подтвердило интернализацию A2E в течение 6-часового инкубационного периода, как было опубликовано ранее [37].

Рисунок 3. Накопление и токсичность A2E в клетках RPE.

А . Конфокальная визуализация накопления A2E в клетках RPE при различных концентрациях A2E в культуральной среде. Отдельные клетки можно обнаружить по их клеточным ядрам (синее окрашивание DAPI), в то время как инкубация A2E связана с появлением аутофлуоресцентных точек (зеленые) в клетках RPE.Обратите внимание на постепенное увеличение автофлуоресценции A2E в клетках RPE с увеличением концентраций A2E, внесенных в инкубационную среду в течение 6 часов. В . Кривая доза-ответ токсичности А2Е для клеток РПЭ. Выживаемость клеток определяли количественно с помощью анализа CellTiter-Glo® через 24 часа после 6-часовой инкубации A2E. Потеря выживаемости клеток была обнаружена при концентрациях A2E более 45 мкМ с IC50 при 67,5 мкМ. (n = 3, r ² = 0,9727). Масштабная шкала соответствует 20 мкм.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0071398.g003

Рис. 4. Характеристика аутофлуоресценции в клетках RPE, нагруженных A2E.

A. Поглощение клеток RPE, обработанных 40 мкМ A2E (A2E + RPE (a), сплошная линия) или необработанных A2E (RPE (b), пунктирная линия). Кривая ((a) — (b), пунктирная линия), представляющая разницу спектров поглощения между клетками RPE, нагруженными A2E (a) и необработанными A2E клетками RPE (b), показывает пики поглощения при 335 и 440 нм. B. Спектры поглощения свободного A2E в чистом этаноле (сплошная линия) или в модифицированной DMEM (пунктирная линия).Спектры одинаковы в обеих средах, и A2E показывает максимумы поглощения при 335 нм и 440 нм. C. Спектры излучения клеток RPE, обработанных 40 мкМ A2E (A2E + RPE (а), сплошная линия) или необработанных (RPE (b), пунктирная линия) при возбуждении 440 нм. Кривая ((a) — (b), пунктирная линия), представляющая разницу между спектрами излучения в клетках RPE, нагруженных A2E (a) и необработанных A2E клетках RPE (b), показывает пик при 620 нм. D. Спектры излучения свободного A2E в чистом этаноле (сплошная линия) или в модифицированной DMEM (пунктирная линия) при возбуждении 440 нм.Спектры одинаковы в обеих средах, и A2E показывает максимум излучения при 640 нм. E. Содержание A2E, определенное с помощью UPLC в клетках RPE после 6 часов инкубации при различных концентрациях A2E (0, 5, 15, 20, 30 и 40 мкМ) в культуральной среде. Содержание A2E в клетках RPE увеличивается линейно в соответствии с инкубированной концентрацией A2E. (n = 4, r ² = 0,9955). (RFU: относительная единица флуоресценции).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071398.g004

В наших руках высокие концентрации A2E (т.е.е. 100 мкМ) оказались токсичными для клеток РПЭ даже в темноте. Действительно, плотность клеток казалась уменьшенной в конце инкубации A2E (рис. 3A). Для точного определения токсичных концентраций A2E в темноте жизнеспособность клеток определяли количественно с помощью анализа жизнеспособности CellTiter-Glo® на клетках RPE, инкубированных с концентрациями A2E в диапазоне от 0 до 100 мкМ. Сигнал жизнеспособных клеток RPE снижался при концентрациях A2E более 45 мкМ. Кривая доза-ответ имела сигмоидальную форму с IC50 при 67,5 мкМ (фиг. 3B).Чтобы избежать этой прямой токсичности А2Е, определение спектра фототоксического действия впоследствии определяли с клетками РПЭ, инкубированными с А2Е при 12,5, 20 или 40 мкМ.

Спектр фототоксического действия на клетки РПЭ, нагруженные А2Е

Чтобы определить точный спектр действия световой токсичности на клетки РПЭ в сине-зеленом диапазоне, мы подвергали нагруженные A2E клетки четырнадцати полосам освещения 10 нм с центром от 390 нм до 520 нм с шагом 10 нм с нормализованным солнечным светом.Клетки РПЭ, нагруженные А2Е, экспонировали на свету в течение 18 часов и исследовали после 6-часового отдыха в темноте. На рисунке 5 показано, что на морфологию клеток РПЭ, нагруженных А2Е, влияло воздействие света с определенными полосами освещения. Даже при инкубации A2E клетки, подвергшиеся воздействию полосы освещения с центром при 480 нм, выглядели здоровыми (рис. 5I – L), чем клетки, находящиеся в темноте (рис. 5A – D). Морфологические изменения были очевидны после воздействия света 440 нм (рис. 5E – H). Эти морфологические изменения усиливались на клетках РПЭ, инкубированных либо с 20 мкМ (рис.5G) или 40 мкМ (фиг. 5H) A2E. Клетки имели тенденцию округляться, терять слияние, и их плотность, казалось, уменьшалась.

Рис. 5. Индуцированные светом морфологические изменения в клетках РПЭ, нагруженных А2Е.

Изображения клеток РПЭ были получены через 6 часов после 18-часового воздействия света с полосой освещения 10 нм с центром при 440 нм ( E – H ), при 480 нм ( I – L ) или в темноте ( A). –D ). Клетки RPE инкубировали с A2E в концентрации 0 мкМ ( A, E, I ), 12.5 мкМ ( B, F, J ), 20 мкМ ( C, G, K ) или 40 мкМ ( D, H, L ). Обратите внимание на желтый оттенок клеток РПЭ, нагруженных A2E, находящихся в темноте ( B – D ). Клетки RPE, обработанные A2E в концентрации 20 мкМ ( G ) или 40 мкМ (H), становились круглыми и теряли слияние после воздействия полосы 10 нм с центром 440 нм. Напротив, клетки RPE, нагруженные A2E, выглядели здоровыми после воздействия полосы 10 нм с центром 480 нм ( J – L ), аналогично клеткам, находящимся в темноте ( B – D ) или необработанным A2E ( A, I ).Масштабная линейка в A представляет 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071398.g005

Для количественной оценки жизнеспособности соответствующих клеток и характеристики возможных дегенеративных событий, вызванных условиями освещения, мы использовали анализ Apotox-Glo ™ (Promega) на клетках RPE. Для каждой отдельной лунки мы измерили 1) жизнеспособность клеток, 2) апоптоз клеток и 3) некроз клеток. Для каждой концентрации A2E и каждого условия освещения измерения усредняли по 4 лункам и нормализовали по отношению к темному контролю (%).Измерения для каждого отдельного условия освещения воспроизводились как минимум в 4-6 независимых экспериментах. Все данные были нормализованы к контрольным условиям без A2E в среде и сохранены в темноте. Эта нормализация была необходима для придания эквивалентного веса всем экспериментам, поскольку плотность клеток незначительно варьировалась между экспериментами, и только 5 различных условий освещения одновременно проверялись в одном эксперименте. Количественная оценка жизнеспособности клеток РПЭ подтвердила фототоксичность полос освещения 440 и 480 нм (рис.6A) Измерения как при 20 мкМ, так и при 40 мкМ A2E показали статистически значимые различия с таковыми для клеток, подвергшихся воздействию света, но в отсутствие обработки A2E. Точно так же различия, наблюдаемые между жизнеспособностью клеток при 40 мкМ A2E и жизнеспособностью клеток при 12,5 или 20 мкМ A2E, также были статистически значимыми. Эти результаты по потере жизнеспособности клеток соответствовали увеличению апоптоза клеток для обоих диапазонов освещения (фиг. 6B). Опять же, различия были статистически значимыми между измерениями при 20 мкМ или 40 мкМ A2E и измерениями в отсутствие A2E, а также между измерениями при 40 мкМ A2E и измерениями при любом 12.5 мкМ или 20 мкМ A2E. Эти результаты свидетельствуют о дозозависимом снижении жизнеспособности клеток РПЭ А2Е и дозозависимом увеличении апоптоза клеток при воздействии света как при 440 нм, так и при 480 нм.

Рисунок 6. Кривые зависимости реакции от дозы A2E фототоксичности, вызванной A2E, на клетки RPE.

( A ) и апоптоз клеток ( B ) были количественно определены с помощью анализа ApoTox-Glo ™ в соответствии с концентрациями A2E (0, 12,5, 20 и 40 мкМ) для клеток RPE, подвергнутых освещению 10 нм. полосы с центром 440 или 480 нм.Жизнеспособность клеток и апоптоз были нормализованы с экспериментальным значением, полученным для клеток RPE, поддерживаемых в темноте без обработки A2E. Значение P было рассчитано с использованием t-критерия. Для двух полос освещения статистически значимые различия указаны в отношении условий освещения, но в отсутствие A2E ( ^# p <0,05, ^## p <0,01, ^### p <0,001) и когда с учетом двух концентраций A2E (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0.001).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071398.g006

Когда экспозиции проводились во всех диапазонах освещения 10 нм в отсутствие обработки A2E, снижение жизнеспособности клеток уже было обнаружено на 420, 430, 440 нм по сравнению с клетками, находящимися в темноте (фиг. 7A). При обработке A2E снижение жизнеспособности клеток распространялось на длины волн от 400 до 470 нм (рис. 7B – D). Некоторые потери жизнеспособности наблюдались также между 480 и 520 нм и даже при 630 нм (рис.7B – D). При 12,5 мкМ самые высокие статистически значимые различия наблюдались для 4 полос освещения с центрами 420, 430, 440 и 450 нм. Наложение уровней освещенности клеток, используемых для каждого условия освещения (красная кривая на фиг. 7D), ясно продемонстрировало, что нет прямой корреляции между уровнем освещенности и потерей жизнеспособности клеток.

Рис. 7. Спектр фототоксического действия на клетки РПЭ, нагруженные А2Е.

( A – D ) Гистограммы жизнеспособности клеток в соответствии с полосами освещения 10 нм с центром от 390 до 520 нм и при 630 нм для необработанных A2E клеток RPE (0 мкМ, A ) или загруженных A2E RPE клетки (концентрации A2E: 12.5 мкМ, B ; 20 мкМ, C ; или 40 мкМ, D ). Уровни жизнеспособности были нормализованы по отношению к флуоресцентному сигналу, измеренному в необработанных A2E клетках в темноте (левая вертикальная ось). ( E – H ) Гистограммы апоптоза клеток в соответствии с полосами освещения 10 нм с центром от 390 до 520 нм и при 630 нм для необработанных A2E клеток RPE (0 мкМ, E ) и клеток RPE, нагруженных A2E ( Концентрации A2E: 12,5 мкМ, F ; 20 мкМ, G ; или 40 мкМ, H ).Апоптоз выражается как отношение люминесцентного сигнала активности каспазы-3/7 к флуоресцентному сигналу жизнеспособности клеток. ( I – L ) Гистограммы некроза клеток в соответствии с полосами освещения 10 нм с центром от 390 до 520 нм и при 630 нм для необработанных A2E клеток RPE (0 мкМ, I ) или клеток RPE, нагруженных A2E ( Концентрации A2E: 12,5 мкМ, J ; 20 мкМ, K ; или 40 мкМ, L ). Уровни некроза нормализованы по флуоресцентному сигналу, измеренному в необработанных А2Е клетках RPE в темноте.Каждая полоса освещения 10 нм обозначена на графиках своей центральной длиной волны. Красные кривые на диаграммах D, H и L представляют среднюю световую освещенность (правая вертикальная ось) для каждой полосы освещения 10 нм. Статистически значимые различия по сравнению с A2E-необработанными клетками, находящимися в темноте (* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071398.g0067

Исследование клеточного апоптоза путем измерения активности каспазы-3/7 в живых клетках показало усиление сигнала с увеличением концентрации A2E.Даже если индукция апоптоза не была обнаружена в отсутствие инкубации A2E (фиг. 7E), увеличение активности каспазы-3/7 уже было статистически значимым для полосы освещения 440 нм при обработке A2E 12,5 мкМ (фиг. 7F). . Повышая концентрацию A2E до 20 или 40 мкМ, апоптоз клеток был обнаружен в 4 узких полосах освещения с центрами 420, 430, 440 и 450 нм (рис. 7G – H). Этот узкий спектральный диапазон, вызывающий запрограммированную гибель клеток, соответствовал спектральным полосам, показывающим большую потерю жизнеспособности клеток (рис.7A – D). Хотя 2-кратное увеличение некроза клеток было обнаружено при увеличении концентрации A2E до 40 мкМ, различия не были статистически значимыми ни при одном из условий освещения по сравнению с клетками, находящимися в темноте (рис. 7I – L). Следовательно, некроз клеток, по-видимому, не способствует потере жизнеспособности клеток, определенной с помощью точной световой специфичности. Эти результаты показывают, что A2E способствует фотоповреждению клеток RPE, что приводит к апоптозу клеток с большей чувствительностью в спектральном диапазоне 415–455 нм.

Обсуждение

Свет часто рассматривается как потенциальный фактор риска дисфункции РПЭ и, следовательно, развития ВМЗ [11] — [17], [41]. Чтобы исследовать спектр фототоксического действия в стареющих клетках РПЭ, заболевание было смоделировано путем загрузки культивируемых клеток РПЭ с A2E [35], [36], [37], [38], [39], фотосенсибилизатором, который накапливается в этих клетках. клетки в процессе старения, как у пациентов с ВМД [38] — [42]. Предыдущие исследования на эту тему использовали либо иммортализованную линию клеток RPE человека, ARPE-19 [37], либо клетки RPE человека [38].Эти различные культивируемые клетки RPE могут накапливать A2E после простой инкубации [37]. На накопление A2E в клетках указывает появление флуоресцентных субклеточных структур, колокализованных с лизозомальным компартментом как в клетках ARPE-19, так и в клетках RPE человека [37], [38]. Включение A2E в культивируемые клетки RPE было дополнительно продемонстрировано количественной оценкой клеток, показывающей дозозависимое увеличение с инкубационными концентрациями A2E. В настоящем исследовании мы воспользовались легким доступом к глазам свиньи для создания первичных культур клеток РПЭ свиней.Загружая клетки с A2E, мы аналогичным образом наблюдали внутриклеточные флуоресцентные точки с увеличивающейся плотностью в соответствии с концентрациями A2E. После возбуждения светом при 440 нм максимум эмиссии A2E был сдвинут с 640 на 620 нм между свободной формой A2E в модифицированной DMEM и внутриклеточной формой A2E. Подобный сдвиг излучения ранее наблюдался с 610 до 565 нм после возбуждения светом на длине волны 380 нм [37]. Однако мы не исследовали судьбу A2E и его превращение в различные производные на свету, как сообщалось ранее [43].Внутриклеточная количественная оценка A2E подтвердила его включение в клетки RPE свиней дозозависимым образом, как ранее сообщалось в клетках RPE человека [37]. Полученное содержание A2E в наших свиных клетках RPE было в тех же диапазонах, что и в культивируемых клетках ARPE-19, нагруженных A2E. Более того, наши клетки, обработанные 12,5 мкМ A2E, демонстрировали внутриклеточное содержимое, аналогичное ранее описанным глазам донора пожилого человека [37]. Эти наблюдения показывают, что наши нагруженные A2E свиные РПЭ ведут себя как ранее описанные модели, обеспечивая тем самым адекватную модель in vitro ARMD.

А2Е является фотосенсибилизатором, запускающим гибель клеток РПЭ человека [38]. Потеря жизнеспособности клеток после воздействия света была ранее показана с помощью колориметрического анализа МТТ, измеряющего метаболическую активность [38]. В клетках ARPE-19, нагруженных A2E, индуцированная светом дегенерация была продемонстрирована путем тестирования проницаемости клеточной мембраны для флуоресцентных красителей [36]. Индукция апоптоза клеток была дополнительно проиллюстрирована фрагментацией ДНК, выявленной с помощью окрашивания TUNEL [36], и активацией каспазы-3 [40].В нашей модели мы также подтвердили проницаемость клеточной мембраны и активацию каспазы-3/7 с помощью анализа ApoTox-Glo Triplex ™. Кроме того, мы показали отсутствие непосредственной цитотоксичности и, следовательно, некроза, измеренного по высвобождению протеазы, за исключением неспецифической токсичности A2E выше 45 мкМ (фиг. 3B). В клетках ARPE-19 апоптоз требовал инкубации A2E при 100 мкМ с последующей световой стимуляцией, в то время как потеря жизнеспособности в клетках RPE человека достигалась последовательными инкубациями с комплексами A2E-LDL [38]. В нашем исследовании инкубация A2E при концентрациях выше 45 мкМ была токсичной для клеток RPE свиней с IC50 67 мкМ даже в темноте.Более того, свет сдвигал дозозависимую индукцию апоптоза клеток A2E в сторону более низких концентраций A2E.

Сообщалось об индуцированной светом дегенерации клеток РПЭ человека, нагруженных A2E, при широкополосном освещении от 390 до 550 нм с освещенностью 2,8 мВт / см. ² [38]. В этом случае значительная световая токсичность была получена после как минимум 72-часового воздействия света. Аналогичное широкополосное освещение от 390 до 750 нм, но с более высокой интенсивностью на 2 логарифма (246 мВт / см ² ) также было токсичным для нагруженных A2E клеток ARPE-19, но в течение всего лишь 20-минутного воздействия света [35].Более того, ограниченное 15–60-секундное воздействие синим светом при 480 нм ± 20 нм на клетки ARPE-19 оказалось значительно более токсичным, чем воздействие зеленым светом при 545 ± 15 нм, даже несмотря на то, что клетки подвергались значительно более сильному облучению зеленым светом. (210 мВт / мм ² ), чем с синим светом (75 мВт / мм ² ) [36]. Как следствие, вызванная светом потеря клеток была значительно снижена (от 78 до 82%) за счет ослабления синего света с помощью интраокулярной линзы, которая полностью блокирует свет ниже 400 нм, линейно увеличивая его пропускание до 450 нм и затем отображая более неглубокое увеличение пропускания на более высоких длинах волн до 800 нм [35].Совсем недавно защита клеток была продемонстрирована путем фильтрации спектрального диапазона от 390 до 460 нм [39]. Хотя все эти исследования ясно свидетельствовали о большей токсичности синего света, они не позволили исследователям определить наиболее опасные длины волн, достигающие сетчатки при усредненном дневном свете. Чтобы ответить на этот конкретный вопрос, мы сначала рассчитали среднюю освещенность солнечным светом, достигающего сетчатки, с учетом пропускания среды глаза. Во-вторых, мы нормализовали уровни освещенности для облучения клеток относительно освещенности сетчатки солнечным светом.Практически клетки экспонировали в течение 18 часов с полосами освещения 10 нм (14 полос, равномерно распределенных в сине-зеленом диапазоне с шагом 10 нм, с первой полосой с центром на 390 нм и доходящей до 520 нм). Таким образом, мы продемонстрировали потерю жизнеспособности клеток на всех протестированных длинах волн, но с более значительными и статистически значимыми различиями под четырьмя полосами освещения 10 нм с центрами 420, 430, 440 и 450 нм. Апоптоз клеток также значительно увеличивался при тех же четырех полосах освещения при двух самых высоких концентрациях A2E (20 мкМ и 40 мкМ).Эти результаты предполагают, что спектральный диапазон 415–455 нм может быть наиболее опасным светом для пациентов с риском ARMD. Эти результаты показывают, что ни энергия длины волны, ни интенсивность света не являются преобладающими факторами фотоповреждения клеток РПЭ. Вместо этого обнаружено, что фототоксичность, зависящая от длины волны, перекрывается с максимумом видимого поглощения клеток RPE, нагруженных A2E. Следовательно, токсичность синего света для клеток RPE, вероятно, представляет собой сложную интеграцию между интенсивностью света, длиной волны энергии и спектром поглощения A2E.

Световые повреждения были исследованы другими исследовательскими группами не только in vitro , как обсуждалось выше, но также in vivo на различных моделях животных. Например, их исследовали при очень интенсивном освещении в течение короткого периода времени, например, 3000 люкс в течение до 2 часов у крыс-альбиносов. Дегенерация фоторецепторов произошла менее чем за 90 минут, тогда как апоптоз клеток РПЭ задерживался на несколько часов [44]. Использование двух разных животных моделей мышей с дефицитом родопсина и RPE65 показало, что активация родопсина необходима для запуска этой дегенерации фоторецепторов [45].При тестировании различных полос освещения синий свет (403 ± 10 нм) приводил к серьезным повреждениям сетчатки, тогда как зеленый свет (550 ± 10 нм) не оказывал токсического действия [25]. Этот токсический эффект синего света был приписан фотообращению обесцвечивания родопсина, которое может происходить при синем, но не зеленом свете, увеличивая, таким образом, способность сетчатки улавливать фотоны [25]. Это повреждение фоторецептора синим светом может поэтому отличаться от повреждения синим светом клеток RPE. Этот вывод был дополнительно подтвержден наблюдениями за гибелью клеток РПЭ у мышей, подвергшихся воздействию синего света, без родопсина [25].Однако это повреждение in vivo синим светом клеток RPE может также отличаться от вызванных A2E повреждений клеток RPE, потому что сетчатка мыши с нокаутом родопсина вряд ли будет генерировать образование A2E после блокады RPE65 [46]. Это повреждение in vivo синим светом клеток RPE может быть более релевантным для повреждения RPE, наблюдаемого в наших руках в отсутствие A2E. Однако вызванное A2E световое повреждение клеток RPE может иметь отношение к ранней дистрофии RPE / фоторецепторов, связанной с индуцированной светом дегенерацией фоторецепторов, недавно описанной на моделях мышей с аномальным накоплением A2E [47], [48].Фактически, эти мыши даже считались животными моделями ARMD, поскольку они демонстрируют несколько основных характеристик ARMD, таких как накопление липофусцина, друзы, гибель клеток RPE, активация комплемента и даже хориоидальная неоваскуляризация [49]. Поэтому в будущих исследованиях следует выяснить, является ли спектр фототоксического действия, определенный в нашем исследовании in vitro на клетках RPE, нагруженных A2E, аналогичным образом более токсичным во время индуцированной светом дегенерации в этих моделях ARMD на животных, и может ли фильтрация соответствующих длин волн эффективно предотвращать дегенерация РПЭ / фоторецепторов и даже подавление других осложнений.

Участие света в развитии ARMD было подтверждено эпидемиологическими исследованиями и благотворным влиянием макулярных пигментов, а также других антиоксидантов. Макулярные пигменты представляют собой естественные защитные фильтры, ослабляющие синий свет в диапазоне от 400 до 500 нм с пиками при 452 и 463 нм для лютеина и зеаксантина соответственно. Их абсорбция и, следовательно, их концентрация в сетчатке, как известно, уменьшается с возрастом [50], [51], [52]. Таким образом, их пищевые добавки с высоким содержанием могут снизить риск позднего ARMD [53] и даже улучшить зрительные функции у пациентов с тяжелым ARMD [54].Все эти выводы согласуются с механизмом световой токсичности в диапазоне синего света. Фактически, эта естественная защита использовалась для создания широких фильтров, блокирующих синий цвет, и интраокулярных линз [55], [56], [57], [58]. Однако, если физиопатология ARMD основана на фотосенсибилизации A2E, наш результат предполагает, что фильтрация света в более узкой полосе от 415 до 455 нм может быть достаточной для предотвращения или ограничения развития или прогрессирования заболевания. Этот более точный и более узкий спектр фототоксического действия может быть выгодно оценен в селективных фотозащитных офтальмологических фильтрах, которые ограничивают нарушение цветового зрения и невизуальных функций, в отличие от современных интраокулярных линз с синей фильтрацией [59].Действительно, фильтры в нашей узкой полосе пропускания не будут перекрывать свет в диапазоне 460–500 нм, который важен не только для цветового зрения, но также для сужения зрачка и регуляции циркадного ритма, которые опосредуются чувствительными к меланопсину ганглиозными клетками сетчатки. Поэтому в будущих исследованиях необходимо будет оценить, могут ли новые селективные офтальмологические фильтры в определенной здесь полосе пропускания от 415 до 455 нм обеспечить защиту желтого пятна у пациентов с риском ARMD.

Материалы и методы

Расчет светового режима

Чтобы имитировать физиологические условия освещения на сетчатке, клетки РПЭ подвергали воздействию нормализованного светового спектра, полученного путем применения фильтрации с помощью окулярной среды в эталонном солнечном спектре.Использовался наземный стандартный эталонный солнечный спектр ASTM G173-03 (международный стандарт ISO 9845–1, 1992), включая прямой луч от Солнца плюс околосолнечную составляющую в диске 2,5 ° вокруг Солнца. Спектр отклоняется от простой модели переноса солнечного света в атмосфере (SMARTS) версии 2.9.2. Уровни освещенности сетчатки E _e , _retina (Вт / м ² ), создаваемые воздействием солнца, были определены с использованием упрощенной модели глаза / источника света, адаптированной из [42] (рис.1А). Источник света описывается его энергетической яркостью L _{e, λ, источником} (λ) (Вт / ср / м ² ), измеренной в направлении зрачка и его излучающей поверхностью S _{источник} (м ² ). Предполагается, что источник мал по сравнению с расстоянием u (м) между источником и роговицей. Предполагается, что плоскость роговицы, плоскость зрачка и узловые плоскости накладываются друг на друга. Поверхность сетчатки S _{сетчатка} , освещенная источником света, пропорциональна поверхности источника S _{источника} , согласно формуле:

где u ‘- длина глаза (м).

Во-первых, для каждой длины волны энергетическая освещенность роговицы E _{e, роговица} (Вт / м ² ), создаваемая излучающей поверхностью S _{источник} энергетического излучения L _{e, λ, источник} рассчитано по формуле:

Затем для каждой длины волны мощность излучения, попадающего в зрачок, была рассчитана по формуле:

, где A _зрачок — поверхность зрачка (m ² ) и рассчитано для размера зрачка 5 мм.

Прежде чем достичь сетчатки, мощность излучения ослабляется коэффициентом пропускания τ (λ) окулярных сред: роговицы, водянистой влаги, хрусталика и стекловидного тела (рис. 1B). Таким образом, для каждой длины волны уровень освещенности сетчатки E _e , _retina (λ) был выведен из мощности излучения, входящего в зрачок Φ _e , _зрачок (λ) с применением естественной фильтрации тканей глаза ребенка [42], [60] (Рис. 1B – C):

с размером зрачка 5 мм и длиной глаза 17 мм:

Чтобы ускорить световое повреждение в нашей модели in vitro , клетки РПЭ подвергались в течение 18 часов облучению, нормализованному к рассчитанному облучению, достигающему сетчатки E _e , _{сетчатка} , но умноженному на коэффициент f, равный 66 ( Инжир.1D).

Светоизлучающий прибор

Специальное волоконное осветительное устройство на основе светодиодов было специально разработано для освещения ячеек РПЭ (рис. 2А). Первый оптический блок (блок 1, рис. 2А) генерировал свет под управлением компьютера для обеспечения уровней градиентной освещенности от 0 мВт / см ² до 10 мВт / см ² . Было использовано пятнадцать световых каналов, каждый из которых состоит из светодиодов, отфильтрованных интерференционными полосовыми фильтрами с полосой пропускания 10 нм. Четырнадцать полос были равномерно распределены с шагом 10 нм в сине-зеленом диапазоне, при этом первая полоса была сосредоточена при 390 нм и доходила до 520 нм.Дополнительную полосу устанавливали на 630 нм в качестве контроля.

Генератор света находился вне инкубатора, чтобы предотвратить нарушение роста клеток РПЭ из-за выделения тепла или вибрации. Пять различных полос освещения генерировались и передавались одновременно пучками оптических волокон, входящими в инкубатор на дно пяти частей 96-луночного планшета для культивирования (блок 2, рис. 2A и B). Для обеспечения равномерного освещения на каждом участке, состоящем из 16 скважин, использовались конические гомогенизирующие стержни для световых труб (рис.2Б). Для каждого канала освещения программное обеспечение, контролирующее уровни освещенности, было откалибровано по расчетным значениям освещенности, достигающим ячеек, как описано выше. Для каждого планшета с 16 лунками постоянно поддерживали в темноте.

Измерения уровня освещенности и однородности были последовательно оценены с использованием (i) откалиброванного спектрорадиометра JAZ (Ocean Optics®, Данидин, Флорида, США) с косинусоидальным корректором и калиброванного по абсолютной освещенности и (ii) измерителя оптической мощности (Coherent Inc. ®, Санта-Клара, США), с фотодиодом с общей активной площадью 0 мкм.4 см ² . Контроль квадратичной производной включал (i) точность спектрорадиометра, (ii) положение лунки на участке и (iii) исследование повторяемости. Измеренная освещенность клеток соответствовала целевым. Спектральные диапазоны шириной 10 нм оценивались с помощью спектрорадиометра JAZ (Ocean Optics®) от 4 до 6 раз. Полная освещенность оценивалась до и после каждого эксперимента с помощью спектрорадиометра JAZ (Ocean Optics®).

Синтез A2E

A2E был синтезирован Orga-link (Magny-Les-Hameaux, Франция) по модифицированной методике, основанной на ранее описанном методе [20].Вкратце, полностью транс-ретиналь (880 мкМ – 1 экв.), Этаноламин (387 мкМ – 0,44 экв.) И уксусная кислота (387 мкМ – 0,44 экв.) Смешивали в абсолютном этаноле (8 мл) в темноте. Темно-оранжевый раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 7 дней. Растворитель выпаривали и неочищенный продукт (250 мг) очищали препаративной ВЭЖХ в темноте, чтобы выделить А2Е (25,3 мкМ – 5,8%) с чистотой 98% ВЭЖХ. A2E хранили при -80 ° C в темных флаконах после разведения в ДМСО до конечной концентрации 50 мМ.

Световое облучение клеток РПЭ, нагруженных A2E

Свиные глаза были куплены на местной бойне (Ги Харанг, Удан, Франция) по согласованию с местным регуляторным департаментом и ветеринарами бойни.Эта процедура соответствует европейской инициативе по ограничению экспериментов на животных, потому что ни одно животное не было убито во время наших экспериментов. Глаза были взяты у животных, которых ежедневно приносили в жертву для употребления в пищу человеком. Глаза очищали от мышц и инкубировали в течение 4 минут в Pursept-AXpress (Merz Hygiene GmbH, Франкфурт, Германия) для дезинфекции. Переднюю часть разрезали вдоль лимба для удаления роговицы, хрусталика и сетчатки. Раствор, содержащий 0,25% трипсин-ЭДТА (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США), вводили на 1 час при 37 ° C в наглазник.Затем клетки RPE осторожно отделяли от мембраны Бруха и ресуспендировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Life Technologies), с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Life Technologies) и 10 мкг / мл гентамицина (Life Technologies). Очищенные клетки от 6 до 8 глаз объединяли и помещали в чашки Петри диаметром 60 мм, равные количеству подготовленных глаз. Клеткам позволяли расти в инкубаторе с контролируемой атмосферой при 5% CO2 и 37 ° C. Питательную среду обновляли через 24 часа после первого посева.Когда клетки достигли слияния (около 3 дней), их отделяли от чашки Петри 5-минутной обработкой 0,05% трипсином-ЭДТА при 37 ° C. Затем их ресуспендировали в DMEM с добавлением 20% FBS и 10 мкг / мл гентамицина и высевали в черный 96-луночный планшет с прозрачным дном по 75000 клеток на лунку.

A2E добавляли в культуральную среду через 72 часа после посева в 96-луночный планшет, когда клетки RPE становились конфлюэнтными. Среду DMEM-20% SVF удаляли и заменяли на DMEM без сыворотки, но содержащую A2E от 0 до 100 мкМ.Во всех условиях конечную концентрацию ДМСО доводили до 0,1%. Через шесть часов клетки дважды промывали в модифицированной среде DMEM без какого-либо фотосенсибилизатора, такого как феноловый красный, рибофлавин, фолиевая кислота и ароматические аминокислоты.

Кривая доза-ответ токсичности A2E оценивалась с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, Fitchburg, WI, USA) в соответствии с протоколом производителя. Впоследствии жизнеспособность клеток была определена количественно с помощью анализа ApoTox-Glo ™ (Promega), который также предоставляет информацию об апоптозе и некрозе.Для экспериментов со спектром фототоксического действия клетки подвергали воздействию света в течение 18 часов, а затем выдерживали в темноте в течение 6 часов перед анализом ApoTox-Glo ™ (Promega). Все измерения были усреднены по 4 лункам для каждой полосы освещения и каждой концентрации A2E. Затем значения были нормализованы до контрольного значения в темноте. Измерения, выполненные на микропланшетном ридере Infinite® M1000 (TECAN, Männedorf, Швейцария), были повторены для каждой полосы освещения в 4-6 независимых экспериментах.

Количественное определение A2E в ячейках RPE

Клетки инкубировали в течение 6 часов в 5, 15, 20, 30 или 40 мкМ A2E.Затем их промывали 3 раза модифицированной DMEM для удаления оставшегося внеклеточного A2E. Затем клетки извлекали с помощью 7-минутной обработки 0,05% трипсином-ЭДТА и ресуспендировали в фосфатно-солевом растворе (PBS, Life Technologies). Клетки дважды смешивали с Polytron PT MR2100 (Kinematica AG, Люцерн, Швейцария) в течение 45 секунд и хранили при -80 ° C в темных флаконах. Все эти действия проводились в темноте при красном свете.

Незамороженные экстракты клеток РПЭ гомогенизировали раствором хлороформ-метанол (2: 1 мл).A2E экстрагировали трижды одним и тем же органическим раствором. После удаления всего растворителя в вакууме каждый образец растворяли в метаноле (200 мкл) и фильтровали (0,2 мкм) перед анализом UPLC. Для анализа UPLC стандарты и образцы вводили в колонку с обращенной фазой (C18) (HSS C18, Waters, 2,1 × 50 мм – 1,7 мкм) и элюировали градиентом метанола в воде (80–92% метанола + 0,1% HCOOH, 0,6 мл / мин, система Waters UPLC Acquity). Детектор масс-спектроскопии с тройным квадруполем (Waters) в режиме SIR (регистрация одиночных ионов — m / z = 592.45– M +) использовали для количественного определения A2E. Концентрацию A2E в клетках RPE определяли по интегрированным площадям пиков и выражали в нанограммах на 10 ⁵ клеток. Внутриклеточное количественное определение А2Е повторяли в 4 независимых экспериментах.

Автофлуоресцентная визуализация клеток РПЭ

A2E проводили на фиксированных клетках после инкубации A2E при различных концентрациях от 0 до 100 мкМ на 8-камерных предметных стеклах Lab-Tek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Клетки фиксировали 15 минут при 4 ° C с 4% (вес / объем) параформальдегидом в PBS (0,01 M, pH 7,4). Ядра клеток выявляли при инкубации клеток с 10 мкг / мл 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Mo, USA) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки промывали и устанавливали реагентом Permafluor® (Microm, Francheville, France). Изображения получали с помощью вертикального конфокального микроскопа Olympus FV1000 с идентичными настройками для каждой концентрации A2E и 40-кратным объективом с фильтрами возбуждения / излучения 488/520 нм.Изображения ядер, окрашенных DAPI, получали с использованием фильтров возбуждения / испускания 405/461 нм.

Спектры поглощения A2E

Спектры поглощения A2E измеряли с помощью микропланшетного ридера TECAN infinite M1000 либо на свободном растворенном A2E, либо на клетках RPE. Свободный А2Е растворяли в этаноле или в модифицированной среде DMEM. Спектр поглощения измеряли на живых клетках RPE, инкубированных в течение 6 часов в модифицированной среде DMEM, содержащей 40 мкМ A2E, а затем промывали 3 раза.

Статистический анализ

Статистический анализ влияния света на жизнеспособность клеток РПЭ, активность каспазы-3/7 и некроз проводили с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 6.После уточнения статистический анализ был выполнен с использованием t-критерия. В противном случае использовали односторонний дисперсионный анализ для сравнения дисперсий между группами при каждой концентрации A2E. В случае значительных различий средние значения для каждой длины волны сравнивали с контрольной группой в темноте с помощью теста множественного сравнения Даннета. Различия считались достоверными при * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: EA FV EG TV DCT JAS SP.Проведены эксперименты: EA CB CN PG KB. Проанализированы данные: EA CB. Предоставленные реактивы / материалы / инструменты анализа: CB FV VF TV. Написал статью: EA CB KB SP TV.

Ссылки

1. 1. Конгдон Н., О’Колмейн Б., Клавер С.К., Кляйн Р., Муньос Б. и др. (2004) Причины и распространенность нарушений зрения среди взрослых в США. Arch Ophthalmol 122: 477–485.
2. 2. Фридман Д.С., О’Колмейн Б.Дж., Муньос Б., Томани С.К., Маккарти С. и др. (2004) Распространенность возрастной дегенерации желтого пятна в США.Arch Ophthalmol 122: 564–572.
3. 3. Rein DB, Wittenborn JS, Zhang X, Honeycutt AA, Lesesne SB, et al. (2009) Прогнозирование возрастной дегенерации желтого пятна до 2050 года: потенциальное влияние новых методов лечения. Arch Ophthalmol 127: 533–540.
4. 4. Смит В., Ассинк Дж., Кляйн Р., Митчелл П., Клэйвер С.С. и др. (2001) Факторы риска возрастной дегенерации желтого пятна: объединенные данные с трех континентов. Офтальмология 108: 697–704.
5. 5. Augood CA, Vingerling JR, de Jong PT, Chakravarthy U, Seland J, et al.(2006) Распространенность возрастной макулопатии у пожилых европейцев: Европейское исследование глаз (EUREYE). Arch Ophthalmol 124: 529–535.
6. 6. Seddon JM, Reynolds R, Yu Y, Daly MJ, Rosner B (2012) Модели риска прогрессирования до поздней возрастной дегенерации желтого пятна с использованием демографических, экологических, генетических и глазных факторов. Офтальмология 118: 2203–2211.
7. 7. Cruickshanks KJ, Klein R, Klein BE, Nondahl DM (2001) Солнечный свет и 5-летняя заболеваемость ранней возрастной макулопатией: исследование глаза бобровой плотины.Arch Ophthalmol 119: 246–250.
8. 8. Тейлор Х.Р., Вест С., Муньос Б., Розенталь Ф.С., Бресслер С.Б. и др. (1992) Долгосрочное воздействие видимого света на глаза. Arch Ophthalmol 110: 99–104.
9. 9. Young RW (1992) Солнечный свет и возрастные заболевания глаз. J Natl Med Assoc 84: 353–358.
10. 10. Mitchell P, Smith W, Wang JJ (1998) Цвет радужки, чувствительность кожи к солнцу и возрастная макулопатия. Исследование глаз Голубых гор. Офтальмология 105: 1359–1363.
11. 11. Флетчер А.Е., Бентам Г.К., Агнью М., Янг И.С., Аугуд С. и др. (2008) Воздействие солнечного света, антиоксиданты и возрастная дегенерация желтого пятна. Arch Ophthalmol 126: 1396–1403.
12. 12. Батт А.Л., Ли Э.Т., Кляйн Р., Рассел Д., Огола Г. и др. (2011) Факторы распространенности и риска возрастной дегенерации желтого пятна у индейцев Оклахомы: исследование Vision Keepers. Офтальмология 118: 1380–1385.
13. 13. Войникович Б., Синек С., Микович В., Телезар М., Линсак З. (2010) Эпидемиологическое исследование воздействия солнца и повреждения поля зрения у детей в Приморско-Горанском уезде — факторы риска более раннего развития дегенерации желтого пятна.Coll Antropol 34 Suppl 257–59.
14. 14. Суй Джи, Лю Дж., Лю Джи, Гао Й., Дэн Й и др. (2013) Является ли воздействие солнечного света фактором риска возрастной дегенерации желтого пятна? Систематический обзор и метаанализ. Br J Ophthalmol. 97: 389–394.
15. 15. Klein R, Cruickshanks KJ, Nash SD, Krantz EM, Javier Nieto F, et al. (2010) Распространенность возрастной дегенерации желтого пятна и связанных факторов риска. Arch Ophthalmol 128: 750–758.
16. 16. Базан Х. Э., Базан Н. Г., Фини-Бернс Л., Берман Э. Р. (1990) Липиды в обогащенных липофусцином субклеточных фракциях человека двух возрастных популяций.Сравнение с стержневыми наружными сегментами и нервной сетчаткой. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 31: 1433–1443.
17. 17. Ng KP, Gugiu B, Renganathan K, Davies MW, Gu X и ​​др. (2008) Протеомика липофусцина пигментного эпителия сетчатки. Протеомика клеток Mol 7: 1397–1405.
18. 18. Sparrow JR, Wu Y, Kim CY, Zhou J (2010) Фосфолипид встречает полностью трансретинальный: создание бисретиноидов RPE. J. Lipid Res. 51: 247–261.
19. 19. Бен-Шабат С., Итагаки Ю., Джокуш С., Воробей-младший, Турро Нью-Джерси и др.(2002) Образование нонаоксирана из A2E, липофусцинового флуорофора, связанного с дегенерацией желтого пятна, и свидетельства участия синглетного кислорода. Angew Chem Int Ed Engl 41: 814–817.
20. 20. Parish CA, Hashimoto M, Nakanishi K, Dillon J, Sparrow J (1998) Выделение и одноэтапное приготовление A2E и iso-A2E, флуорофоров из пигментного эпителия сетчатки человека. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 14609–14613.
21. 21. Хантер Дж. Дж., Морган Дж. И., Мериган WH, Слайни Д.Х., Воробей Дж. Р. и др.(2012) Восприимчивость сетчатки к фотохимическим повреждениям от видимого света. Prog Retin Eye Res 31: 28–42.
22. 22. Ван Норрен Д., Горгельс Т.Г. (2011) Спектр действия фотохимического повреждения сетчатки: обзор данных монохроматического порога. Photochem Photobiol 87: 747–753.
23. 23. Lawwill T (1982) Три основных патологических процесса, вызываемых светом в сетчатке приматов: поиск механизмов. Trans Am Ophthalmol Soc 80: 517–579.
24. 24.Lund DJ, Stuck BE, Edsall P (2006) Пороги повреждения сетчатки для лазеров с синей длиной волны. Физика здоровья 90: 477–484.
25. 25. Гримм С., Венцель А., Уильямс Т., Рол П., Хафези Ф. и др. (2001) Опосредованное родопсином повреждение сетчатки крысы синим светом: эффект фотообращения обесцвечивания. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 42: 497–505.
26. 26. Ван Норрен Д., Шеллекенс П. (1990) Опасность синего света у крысы. Видение Res 30: 1517–1520.
27. 27. Горгельс Т.Г., ван Норрен Д. (1995) Ультрафиолет и зеленый свет вызывают различные типы повреждений сетчатки глаза крысы.Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 36: 851–863.
28. 28. Putting BJ, Van Best JA, Vrensen GF, Oosterhuis JA (1994) Вызванная синим светом дисфункция гемато-ретинального барьера пигментного эпителия у кроликов-альбиносов по сравнению с пигментированными кроликами. Exp Eye Res 58: 31–40.
29. 29. Putting BJ, van Best JA, Zweypfenning RC, Vrensen GF, Oosterhuis JA (1993) Спектральная чувствительность гемато-ретинального барьера пигментного эпителия к синему свету в диапазоне 400–500 нм. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 231: 600–606.
30. 30. Putting BJ, Zweypfenning RC, Vrensen GF, Oosterhuis JA, van Best JA (1992) Дисфункция гемато-ретинального барьера в пигментном эпителии, индуцированная синим светом. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 33: 3385–3393.
31. 31. Putting BJ, Zweypfenning RC, Vrensen GF, Oosterhuis JA, van Best JA (1992) Дисфункция и восстановление гемато-сетчатого барьера после воздействия белого света: флуорофотометрическое и гистологическое исследование. Exp Eye Res 54: 133–141.
32. 32.Van Best JA, Putting BJ, Oosterhuis JA, Zweypfenning RC, Vrensen GF (1997) Функция и морфология пигментного эпителия сетчатки после повреждения, вызванного светом. Microsc Res Tech 36: 77–88.
33. 33. Wihlmark U, Wrigstad A, Roberg K, Nilsson SE, Brunk UT (1997) Накопление липофусцина в культивируемых пигментных эпителиальных клетках сетчатки вызывает повышенную чувствительность к облучению синим светом. Free Radic Biol Med 22: 1229–1234.
34. 34. Дэвис С., Эллиотт М.Х., Флор Е, Траскотт Т.Г., Зареба М. и др.(2001) Фотоцитотоксичность липофусцина в клетках пигментного эпителия сетчатки человека. Free Radic Biol Med 31: 256–265.
35. 35. Sparrow JR, Miller AS, Zhou J (2004) Поглощающая синий свет интраокулярная линза и защита пигментного эпителия сетчатки in vitro. J Cataract Refract Surg 30: 873–878.
36. 36. Sparrow JR, Nakanishi K, Parish CA (2000) Флуорофор А2Е липофусцина опосредует индуцированное синим светом повреждение пигментированных эпителиальных клеток сетчатки. Инвестируйте офтальмол Vis Sci 41: 1981–1989.
37. 37. Sparrow JR, Parish CA, Hashimoto M, Nakanishi K (1999) A2E, липофусциновый флуорофор в пигментированных эпителиальных клетках сетчатки человека в культуре. Инвестируйте офтальмол Vis Sci 40: 2988–2995.
38. 38. Schutt F, Davies S, Kopitz J, Holz FG, Boulton ME (2000) Фотоповреждение человеческих клеток RPE с помощью A2-E, ретиноидного компонента липофусцина. Инвестируйте офтальмол Vis Sci 41: 2303–2308.
39. 39. Чжоу Дж., Воробей Дж. Р. (2011) Фильтрация света в модели культуры пигментных эпителиальных клеток сетчатки.Optom Vis Sci 88: 759–765.
40. 40. Sparrow JR, Cai B (2001) Индуцированный синим светом апоптоз А2Е-содержащего РПЭ: участие каспазы-3 и защита Bcl-2. Инвестируйте офтальмол Vis Sci 42: 1356–1362.
41. 41. Westlund BS, Cai B, Zhou J, Sparrow JR (2009) Участие c-Abl, p53 и MAP-киназы JNK в программе гибели клеток, инициированной в A2E-нагруженных клетках ARPE-19 под воздействием синего света. Апоптоз 14: 31–41.
42. 42. Boettner EA, Wolter JR (1962) Передача глазных сред.Следственная офтальмология 1 (6).
43. 43. Воробей-младший, Чжоу Дж., Бен-Шабат С., Фоллмер Х., Итагаки Ю. и др. (2002) Участие окислительных механизмов в индуцированном синим светом повреждении А2Е-нагруженного РПЭ. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 43: 1222–1227.
44. 44. Hafezi F, Marti A, Munz K, Reme CE (1997) Светоиндуцированный апоптоз: разное время в сетчатке и пигментном эпителии. Exp Eye Res 64: 963–970.
45. 45. Гримм С., Венцель А., Хафези Ф., Ю. С., Редмонд TM и др.(2000) Защита мышей с дефицитом Rpe65 идентифицирует родопсин как медиатор индуцированной светом дегенерации сетчатки. Нат Генет 25: 63–66.
46. 46. Маити П., Конг Дж., Ким С.Р., Воробей Дж. Р., Алликметс Р. и др. (2006) Маломолекулярные антагонисты RPE65 ограничивают зрительный цикл и предотвращают образование липофусцина. Биохимия 45: 852–860.
47. 47. Maeda A, Golczak M, Maeda T, Palczewski K (2009) Ограниченные роли Rdh8, Rdh22 и Abca4 в очищении сетчатки от всех транс-ретиналов в сетчатке мышей.Инвестируйте офтальмол Vis Sci 50: 5435–5443.
48. 48. Maeda A, Maeda T, Golczak M, Palczewski K (2008) Ретинопатия у мышей, вызванная нарушением клиренса всех трансретиналов. J Biol Chem 283: 26684–26693.
49. 49. Маэда Т., Маеда А., Матоски М., Окано К., Роос С. и др. (2009) Оценка потенциальных методов лечения на мышиной модели возрастной дегенерации желтого пятна у человека, вызванной замедленным полностью транс-ретинальным клиренсом. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 50: 4917–4925.
50. 50.Kaya S, Weigert G, Pemp B, Sacu S, Werkmeister RM и др. (2012) Сравнение пигмента желтого пятна у пациентов с возрастной дегенерацией желтого пятна и здоровых контрольных субъектов — исследование с использованием спектрального отражения глазного дна. Acta Ophthalmol 90: e399–403.
51. 51. Раман Р., Раджан Р., Бисвас С., Вайтхесваран К., Шарма Т. (2011) Оптическая плотность макулярного пигмента у населения Южной Индии. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 52: 7910–7916.
52. 52. Геллерманн В., Ермаков И.В., Ермакова М.Р., Макклейн Р.В., Чжао Д.Ю. и др.(2002) In vivo резонансное рамановское измерение макулярных каротиноидных пигментов в сетчатке молодого и стареющего человека. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis 19: 1172–1186.
53. 53. Sabour-Pickett S, Nolan JM, Loughman J, Beatty S (2012) Обзор доказательств, относящихся к предполагаемой защитной роли каротиноидов желтого пятна для возрастной дегенерации желтого пятна. Mol Nutr Food Res 56: 270–286.
54. 54. Вейгерт Г., Кая С., Пемп Б., Саку С., Ласта М. и др. (2011) Влияние добавок лютеина на оптическую плотность макулярного пигмента и остроту зрения у пациентов с возрастной дегенерацией желтого пятна.Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 52: 8174–8178.
55. 55. Rezai KA, Gasyna E, Seagle BL, Norris JR Jr, Rezaei KA (2008) Фильтр AcrySof Natural снижает индуцированный синим светом апоптоз в пигментном эпителии сетчатки человека. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 246: 671–676.
56. 56. Санчес-Рамос С., Вега Дж. А., дель Валле М. Е., Фернандес-Бальбуэна А., Боннин-Ариас С. и др. (2010) Роль металлопротеаз в дегенерации сетчатки, вызванной фиолетовым и синим светом. Adv Exp Med Biol 664: 159–164.
57. 57. Tanito M, Kaidzu S, Anderson RE (2006) Защитные эффекты мягкого акрилового желтого фильтра против повреждения сетчатки у крыс, вызванного синим светом. Exp Eye Res 83: 1493–1504.
58. 58. Уэда Т., Наканиши-Уэда Т., Ясухара Х., Коиде Р., Доусон В.В. (2009) Контроль над повреждением глаз за счет уменьшения синего освещения. Exp Eye Res 89: 863–868.
59. 59. Mainster MA, Turner PL (2010) ИОЛ, блокирующие синий цвет, уменьшают фоторецепцию, не обеспечивая значительной фотозащиты.Surv Ophthalmol 55: 272–289.
60. 60. Беттнер Э.А. (1967) Спектральная передача глаза. Анн-Арбор: Мичиганский университет. 46 с.
61. 61. Le Grand Y (1972) Optique Physiologique, Vol 2, Lumière et Couleurs: Masson & CIE. 490 с.