Как насытить клетки кислородом: Как можно в домашних условиях обеспечить организм кислородом

Подложки к м (O 2 ) (%) H 2 O 2 Производство (PMOL Min -1 · MG Белок −1 ) Глутамат + малат с малонатом 0.025 250 сукцинат (- ротенон) 0,179 330 сукцинат (+ ротенон) 0,070 105 Глутамат, малат и сукцинат 0,050 330 пальмитоилкарнитин (- ротенон) 0,100 290 пальмитоилкарнитин (+ ротенон) 0,398 250 Сайты Комплекс III Q o сайт 0. 199 в 150 Комплекс I ФМН сайт 0,019 170 Комплекс I электронов обратного потока 0,090 135 ETFQOR 0,498 200

Все значения взяты из Hoffman et al. 2009 г. и измерено с помощью анализа пероксидазы Amplex Red/хрена в присутствии супероксиддисмутазы при 37°C.

1.3. НАДФН-оксидазы

Существует семь членов семейства никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН) оксидаз (Nox1–5 и Duox 1 и 2), некоторые из которых (например, Nox1, 2 и 4) довольно широко распространены среди млекопитающих. тканей и клеточных линий [14]. Noxs представляют собой мультисубъединичные трансмембранные ферменты, которые переносят электроны от NAD(P)H через биологические мембраны [15]. Хотя ферменты Nox локализуются на различных клеточных мембранах, все они могут быть обнаружены в плазматической мембране, где они транспортируют электроны к внешнему O ₂ , что приводит к продукции супероксида во внеклеточном пространстве [14]. Супероксид, образующийся вне клетки и дисмутирующийся до H ₂ O ₂ , может диффундировать обратно в исходную клетку или в соседние клетки.

Важно отметить, что недавняя работа указывает на то, что Nox4 отличается от других изоформ Nox по нескольким важным признакам. Во-первых, Nox4 локализуется (по крайней мере, в некоторых клетках и/или некоторых физиологических состояниях) в митохондриях [16], где его активность, по-видимому, связана с дыхательным комплексом I и АТФ [17, 18]. Активность Nox4 не зависит от взаимодействия с дополнительными субъединицами.Кроме того, Nox4 преимущественно производит H ₂ O ₂ , а не супероксид [19]. Уровень продукции Nox4 H ₂ O ₂ также очень чувствителен к уровням O ₂ в диапазоне от физоксиа до 18%.

Удивительно мало данных K _m (O ₂ ) для любой из изоформ Nox. Кроме того, есть некоторые сомнения относительно достоверности некоторых анализов активности Nox с использованием выделенных мембранных фракций [20, 21]. Тем не менее, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что активность Nox1, Nox2 и Nox4 чувствительна к уровням O ₂ в диапазоне от 5% до 18% (таблица 4).Nox4 со значением K _m (O ₂ ) ~18% особенно чувствителен в этом диапазоне; Активность Nox4 утраивается между 3% и 12% O ₂ [19]. Прямые измерения с культивируемыми клетками PC3 и C2C12 указывают на значительный вклад Nox1 и/или Nox4 в продукцию H ₂ O ₂ в живых клетках (измеряется как окисление Amplex Red), особенно при 18% O ₂ , поскольку это значение сильно ингибируется GKT138731 (ингибитор Nox1/4; рис. 2). Точно так же в дермальных фибробластах мыши с тройным нокаутом Nox1/2/4 продукция H ₂ O ₂ при 18% O ₂ составляет лишь около 1/10 от продукции фибробластов дикого типа, а при 5% O ₂ , H ₂ O ₂ продукция не обнаруживается (рис. 2).Таким образом, имеющиеся данные, хотя и несколько ограниченные, указывают на то, что изоформы Nox продуцируют H ₂ O ₂ со скоростью, которая сильно зависит от уровней O ₂ . Это, вероятно, лежит в основе наблюдений, таких как вклад Nox4 в клеточное старение в первичных клеточных линиях, поскольку эти исследования проводились при 18% O ₂ . Неясно, играет ли Nox4 те же роли in vivo , где уровни O ₂ в несколько раз ниже, но это необходимо учитывать.

Фермент Продукт К м (O 2 ) (%) Подробности Ссылка Nox2 вывода 2 — 3.5 [77] Nox2 О 2 — 3,1 [78] Nox2 О 2 — — 2-3 [19] [19] o 2 O 2 — 2-3 [79] Nox4 H 2 O 2 [78] NOx4 H 2 O 2 18 19] NOx4 H 2 O 2 16-20 16-20 [79] [79] [79] [79] NNOS NO 23 Очищенный бычий фермент [45] NNOS NNOS NOO / O 2 — 2. 2 Частично бессмысленный крысиный фермент [42, 43] o 2 — — — 3.4 3.4 60141 NNOS № 15.7 Очищенный крысиный фермент [47] NNOS NO 39.8 Очищенный крысиный фермент [80] NNOS NNOS NOO 28.54141 Кинетическая модель на основе RAT Enzyme Data [81, 82] ENOS № 0,8 0,8 Очищенный бычий фермент [45] [45] [45] [45] [45] enos No NO 0.3 Кинетическая модель на основе данных крысы [82, 83] INOS № 0. 63 ± 0,09 Очищенные бычий фермент [45] Inos NO 11,0 Изолированный ферментативный анализ [84] иОАС NO 10,6 Кинетическая модель [82] NOS № № 3.1-10.8 Неуказанные Isoform [48, 85] XO O 2 · — / H 2 O 2 2.2–6,8 Выделено из коровьего молока Fridovich et al. 1962, 1964 МАО H 2 O 2 3,4–28 Ферменты млекопитающих; различные подложки [86–88]; Отзыв в [57] Co Co Co Co Co Co <1,5 Указанные изоформ из куриной печени [59] Lox H 2 O 2 1–2. 6 НЕ УКАЗАНО ISOFORM [65] COX-1 Различные 0.4-3.1 Арахидоновая кислотная подложка [63, 89-91] COX-2 Различные 1.3-1.5 Арахидоновая кислотная подложка [63, 65] Phd Modified Hif 41-46 41-46 [92] [92] FIF Модифицировано HIF 4–12 Различные субстраты [92]

Nox: НАДФН-оксидаза; NOS: синтаза оксида азота; ХО: ксантиноксидаза; МАО: моноаминоксидаза; HO: гемоксигеназа; LOX: липоксигеназа; ЦОГ: циклооксигеназа; PHD: пролилгидроксилаза; FIH: фактор, ингибирующий HIF-1.

1.4. Трансплазматическая мембранная окислительно-восстановительная система

Трансплазматическая мембранная система переноса электронов (tPMET) представляет собой повсеместную систему для переноса электронов от цитозольного NAD(P)H за пределы клетки, подобно Noxs [22]. Основными компонентами системы tPMET являются NAD(P)H-хиноноксидоредуктаза (NQO1), NADH-цитохром b5 редуктаза (CytB5red), кофермент Q ₁₀ и экто-NADH оксидаза дисульфид тиолообменник (ENox). Как NQO1, так и CytB5red распределяются во множестве внутриклеточных локализаций, в том числе в ассоциации с плазматической мембраной.

Система tPMET вносит значительный вклад в клеточное потребление O ₂ во многих распространенных клеточных линиях (например, Jurkat, RAW264.7 и бета-клетках поджелудочной железы; см. [23, 24]). Система tPMET сильно активируется в клетках с дефицитом дыхания ( ρ ⁰ ), которые накапливают кофермент Q ₁₀ в плазматической мембране [25]. В клетках ρ ⁰ tPMRS может быть преобладающим местом потребления O ₂ [24].

Возможны различные внеклеточные терминальные акцепторы электронов, в том числе O ₂ , которые могут подвергаться восстановлению одного электрона с образованием супероксида. Очищенный CytB5red млекопитающих напрямую продуцирует супероксид [26], хотя его избыточная экспрессия оказывает благотворное влияние в некоторых специфических контекстах [27, 28]. NQO1 связан с внутриклеточной антиоксидантной функцией (например, [29]), но способствует восстановлению внеклеточных акцепторов электронов, предположительно включая O ₂ , в бета-клетках поджелудочной железы [23]. Белки ENox включают несколько изоформ — возрастной arNox может быть наиболее важным с точки зрения продукции АФК в клеточной культуре. Эта изоформа продуцирует супероксид и становится более экспрессированной в тканях старых млекопитающих и в поздних пассажах или стареющих клетках в культуре [30].

Система tPMET была измерена только в стандартной клеточной культуре O ₂ (18%), и нам не известны какие-либо данные о чувствительности продукции супероксида к концентрации O ₂ для системы в целом или для отдельные компоненты системы. Тем не менее, следует учитывать возможность того, что tPMRS является O ₂ чувствительным в диапазоне 5–18% и что O ₂ -зависимые изменения его активности могут влиять на физиологию клеток.

1.5. Роль аквапоринов в трансмембранном H

tPMRS и все изоформы Nox (часть всех изоформ Nox локализуется на плазматической мембране) могут продуцировать либо супероксид, либо H ₂ O ₂ на внеклеточной стороне плазматической мембраны. Здесь эти АФК могут реагировать с мембранами или мембраносвязанными белками, обращенными во внеклеточное пространство исходной клетки или соседних клеток. В качестве альтернативы, H ₂ O ₂ , полученный либо непосредственно, либо в результате дисмутации супероксида, может проникать через клеточные мембраны, оказывая внутриклеточное действие.H ₂ O ₂ проницаемость фосфолипидных бислоев ограничена; действительно, H ₂ O ₂ менее проникает через мембрану, чем H ₂ O [31]. Однако H ₂ O ₂ быстро уравновешивается через клеточные мембраны с помощью аквапоринов (AQP). Структурные исследования предполагают, что все AQP, транспортирующие воду, могут в некоторой степени способствовать перемещению H ₂ O ₂ через клеточные мембраны [32]. Однако эмпирические данные менее двусмысленны, предполагая, что hAQP3 и hAQP8 являются особенно хорошими переносчиками H ₂ O ₂ [31].

Интересно, что уровни O ₂ модулируют экспрессию нескольких AQP. Уровни мРНК и белка AQP1 и AQP3 увеличиваются на 1% по сравнению с 20% O ₂ ([33]; Hoogewijs et al. 2016), хотя экспрессия AQP5 и AQP9 снижается при более низких уровнях O ₂ ([34] ; Кастро-Пароди и др., 2013). Имеются также некоторые доказательства того, что гипоксия может влиять на проницаемость AQP8 напрямую посредством посттрансляционных модификаций [35]. Недавние исследования ([36]; Zwiazek et al. 2017) также предполагают, что некоторые изоформы AQP облегчают транспорт O ₂ и, следовательно, могут способствовать поглощению O ₂ клетками при низких уровнях O ₂ . Имеются также убедительные доказательства того, что AQP1 и AQP4 могут транспортировать другие важные ROS/RNS, такие как NO [37, 38]. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что уровни среды O ₂ , вероятно, модулируют проницаемость H ₂ O ₂ , NO и O ₂ клеточных мембран посредством их влияния на экспрессию и/или активность AQP. Это затрудняет понимание детальной кинетики того, как АФК/РНС и газы пересекают клеточные мембраны in vivo при проведении измерений in vitro в нефизиологических O ₂ условиях.

1.6. Синтазы оксида азота

NOS представляют собой семейство ферментов, ответственных за продукцию NO и L-цитруллина из L-аргинина и O ₂ [39, 40]. Были идентифицированы три изоформы NOS: эндотелиальная NOS (eNOS), нейрональная NOS (nNOS) и индуцируемая NOS (iNOS) [41]. Эти три изоформы NOS имеют примерно 50% аминокислотную идентичность [41], и все три широко экспрессируются в тканях и клеточных линиях млекопитающих. В некоторых условиях, включая временную аноксию/реоксигенацию, NOS катализирует «несвязанную» реакцию с образованием супероксида вместо NO (Stuehr et al.1991 год; [42, 43]; рассмотрен в [44]).

Первое подробное исследование чувствительности O ₂ реакции NOS было проведено Ренгасами и Джонсом [45], которые рассчитали значение K _m (O ₂ ) от 0,63 до 2,31% O ₂ для NOS. выделен из бычьего мозга и эндотелия аорты, а также макрофагов мыши RAW 264.7. Впоследствии значения K _m (O ₂ ) были опубликованы для различных тканей и клеточных линий, а также для конкретных очищенных изоформ NOS (табл. 4).Хотя эти значения сильно различаются, предположительно из-за различий в экспериментальных условиях, обнаружено, что O ₂ сродство nNOS и iNOS относительно постоянно находится в диапазоне, который чувствителен к изменениям уровней O ₂ между physioxia и 18% O ₂ . Таким образом, клеточные линии с высоким уровнем этих двух изоформ будут продуцировать больше NO в стандартных условиях культивирования клеток, чем in vivo . В моделях клеточных культур ишемического/реперфузионного повреждения обычно используют период почти аноксии, за которым следует возврат к «нормоксии», где последняя составляет 18% O ₂ .Активность NOS может быть разобщена в этих условиях, и скорость продукции супероксида при реоксигенации при 18% O ₂ вероятно превышает скорость, которая произошла бы при возвращении к physioxia in vivo .

NO также может быть получен восстановлением нитрита, катализируемым несколькими ферментами, включая XO/XOR [46]. Эта реакция активируется при более низких уровнях O ₂ и затрудняет прогнозирование влияния уровней O ₂ на скорость образования NO. Таким образом, взаимосвязь между скоростью клеточного синтеза NO и уровнями O ₂ будет зависеть от относительного содержания различных изоформ NOS, которые обладают разной чувствительностью к O ₂ .

Помимо воздействия на синтез NO, уровни O ₂ влияют на метаболизм NO ([47, 48]; рассмотрено в [49]). NO метаболизируется в клетках плохо изученными путями. Однако известно, что скорость метаболизма NO клетками выше при более высоких уровнях O ₂ [50]. Таким образом, более высокие уровни O ₂ будут влиять на скорость продукции NO из nNOS и iNOS, одновременно увеличивая скорость их метаболизма. Опять же, трудно предсказать, как это повлияет на установившиеся уровни NO во всех клетках.В активированных клетках RAW 264.7 в культуре максимальные скорости продукции NO наблюдались при 8% O ₂ [50], хотя связь между O ₂ и уровнями NO в других типах клеток неизвестна. Зависимая от O ₂ скорость метаболизма NO, в свою очередь, будет влиять на его диффузионное расстояние и, следовательно, изменять подмножество белков, модифицированных в исходной клетке или соседних клетках. NO участвует во многих регуляторных посттрансляционных модификациях ключевых белков, включая те, которые управляют эпигенетическими модификациями.Учитывая эти разнообразные влияния NO на клеточные функции и влияние уровней O ₂ на синтез, расстояние диффузии и метаболизм NO, существует явный потенциал для получения нефизиологически значимых результатов при нефизиологических уровнях O ₂ .

1.7. Другие оксидазы

XO и МАО представляют собой две широко экспрессируемые клеточные оксидазы, продукты которых включают супероксид и H ₂ O ₂ . XO и его предшественник XOR экспрессируются в клетках млекопитающих, где они локализуются в цитозоле и на внешней поверхности плазматической мембраны [51].И XO, и XOR могут катализировать окисление пуринов с образованием супероксидного радикала и H ₂ O ₂ [52]. При некоторых условиях XO может также катализировать образование NO из нитритов и нитратов, реакция, которая благоприятна при более низких значениях O ₂ [46]. Однако уровни этих последних соединений относительно низки в культуральной среде, и поэтому эта активность может иметь второстепенное значение в культуре клеток млекопитающих. Значение K _m (O ₂ ) бычьего XO находится в диапазоне 3–6% O ₂ (таблица 4).Интересно, что относительное производство супероксида по сравнению с H ₂ O ₂ XO также чувствительно к уровням O ₂ в диапазоне, обнаруженном в культуре клеток (1–21%), так что при уровнях O ₂ ниже 5% O ₂ , H ₂ O ₂ способствуют образованию [53]. Кроме того, высокие уровни O ₂ способствуют посттрансляционным модификациям XOR, снижающим его специфическую активность [54, 55]. Таким образом, уровни O ₂ в культуре могут влиять на относительную скорость продукции АФК с помощью XO/XOR, а также на относительные количества супероксида по сравнению с H ₂ O ₂ .

МАО встречается в виде двух изоформ, МАО-А и МАО-В. Оба широко распространены в тканях млекопитающих [56]. Они локализуются на внешней митохондриальной мембране, где катализируют деградацию биогенных и пищевых моноаминов, таких как норэпинефрин, дофамин, тирамин, серотонин, фенилэтиламин и бензиламин, в результате реакции с образованием H ₂ O ₂ . Сообщаемые значения K _m (O ₂ ) обеих изоформ сильно различаются (таблица 4) из-за сложного механизма реакции, в котором сродство O ₂ сильно зависит от концентрации моноамина (обзор в [57]).Тем не менее предполагается, что активность фермента МАО будет чувствительна к O ₂ в диапазоне 5–18%. Поскольку H ₂ O ₂ , продуцируемый МАО, находится вблизи митохондриального компартмента, аберрантная митохондриальная и цитозольная окислительно-восстановительная передача сигналов и/или повреждение макромолекул могут быть вызваны ферментами МАО в условиях O ₂ , типичных для стандартной клеточной культуры.

1.8. Оксигеназы

Оксигеназы катализируют включение кислорода в органический субстрат.Гемоксигеназа (HOX), липоксигеназа (LOX) и циклооксигеназа (COX) широко экспрессируются в тканях и клеточных линиях млекопитающих. НОХ играет важную роль в процессе деградации гема, в то время как ЦОГ и ЛОГ способствуют расщеплению арахидоновой кислоты двумя отдельными путями.

HOX локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (обзор в [58]). Существуют две изоформы, НОХ-1 и НОХ-2, с идентичностью аминокислотной последовательности >45%. В то время как НОХ-2 конститутивно экспрессируется, НОХ-1 индуцируется эндогенными и экзогенными стрессорами, такими как тяжелые металлы, фармакологические агенты, медиаторы воспаления, УФ-излучение и окислительный стресс. Ферменты НОХ окисляют гем с образованием монооксида углерода, Fe ²⁺ и биливердина. HOX, очищенный из куриной печени, имеет максимальную активность при уровнях O ₂ всего лишь 1,5% ([59]; таблица 4), что указывает на то, что этот фермент, вероятно, насыщен O ₂ даже в клетках, культивируемых в physioxia.

ЦОГ представляет собой диоксигеназу, которая катализирует первую стадию распада арахидоновой или линолевой кислоты, приводящую к образованию производных простаноидов (обзор в [60]). Ферменты ЦОГ модулируют рост клеток и сигнальные пути и участвуют в прогрессировании рака [61].Существуют две изоформы, ЦОГ-1 и ЦОГ-2, с гомологией аминокислотной последовательности ~60%. Ферменты ЦОГ локализуются на мембране эндоплазматического ретикулума и ядерной оболочке. Эти ферменты катализируют двухстадийные реакции. На первом этапе активность циклооксигеназы с использованием молекулярного кислорода приводит к образованию промежуточного соединения гидропероксида простагландина G ₂ . Затем наблюдают активность пероксидазы, что приводит к образованию простагландина H ₂ . Значение K _m (O ₂ ) окисления арахидоновой кислоты, катализируемого ЦОГ-1, варьируется от 0.4% и 3,1% О2, а значение К _м (О ₂ ) ЦОГ-2 несколько ниже (табл. 4). Активность ЦОГ-1 и ЦОГ-2 достигает насыщения примерно при 10–20% O ₂ [62, 63]. Таким образом, эти ферменты также O ₂ чувствительны в интересующем диапазоне, и поскольку их продукты модулируют различные клеточные активности, включая рост и дифференцировку клеток [61], возможно, что их повышенная активность при 18% O ₂ влияет на исследования. физиологии клеток в культуре.

LOX катализирует деоксигенацию полиненасыщенных жирных кислот с образованием различных кислородных и липидных радикалов при некоторых условиях (обзор в [60]).Существует шесть изоформ LOX, которые широко распространены в тканях и клетках млекопитающих. Ферменты LOX продуцируют АФК и липидные радикалы, которые участвуют во внутриклеточных сигнальных путях. Уровни O ₂ сложным образом влияют на липоксигеназную реакцию [64, 65], но измеренные значения K _m (O ₂ ) составляют 1–2,6% O ₂ (табл. 4), что делает скорость реакции O ₂ чувствительность в соответствующем диапазоне.

1.9. Транскрипционная регуляция ферментов, продуцирующих АФК/РНК

В дополнение к резкому влиянию на активность катализируемых ферментами реакций, уровни O ₂ в клеточной культуре могут влиять на экспрессию различных ферментов и органелл, потребляющих O ₂ .HIF-1 и HIF-2 представляют собой гетеродимерные факторы транскрипции, активность которых регулируется O ₂ посредством деградации α -субъединиц (HIF-1 α , HIF-2 α ). Эта реакция катализируется пролилгидроксилазой (PHD), которая использует O ₂ и 2-оксоглутарат для гидроксилирования субъединиц HIF- α , что приводит к их последующему убиквитинированию и деградации. Вторая реакция, гидроксилирование аспарагина в HIF-1 α , катализируемая фактором, ингибирующим HIF-1 (FIH), ингибирует транскрипционную активность HIF-1.Вместе O ₂ регулирует уровни и активность HIF-1 и/или HIF-2. Обе реакции гидроксилирования O ₂ чувствительны в диапазоне физоксиа до 18% O ₂ . Изоформы PHD млекопитающих имеют значение K _m (O ₂ ) ~25% O ₂ и значение FIH K _m (O ₂ ) ~11% (табл. 4). Кроме того, активность PHD может модулироваться ROS/RNS, продуцируемыми многими ферментами, обсуждаемыми выше, с более высокой скоростью в стандартных условиях культивирования.

Сотни генов регулируются транскрипцией с помощью HIF, и, что интересно, среди них находится большинство обсуждавшихся выше ферментов, продуцирующих АФК/РНК. В наших экспериментах относительные уровни Nox1 и Nox4 намного выше на уровне 5% по сравнению с 18% O ₂ (рис. 3). Действительно, Nox4, все три изоформы NOS, LOX, COX, MAO и HOX являются транскрипционными мишенями HIF (таблица 5). Кроме того, несколько AQPs регулируются HIF, что указывает на то, что H ₂ O ₂ проницаемость клеточных мембран, вероятно, отличается при physioxia по сравнению с 18% O ₂ .Важно отметить, что практически все данные, касающиеся HIF-регуляции этих ферментов, были собраны с использованием 18 % O ₂ в качестве «нормоксии» и 1 % O ₂ в качестве гипоксии, но аналогичные результаты ожидаются для 5 % по сравнению с 18 % сравнение.

Эффект Эффект Ссылка Ссылка Nox1 Транспортная стимуляция HIF-1 Goyal et et al.2004 nox4 Транскрипциональных стимуляции [93] нОАС Транскрипционных стимуляции [94] Енос Транскрипционных стимуляции [95] Стабилизации мРНКа . [100] HO Транскрипционная стимуляция [101] Lox Транспортная стимуляция [102] [102] [102] [102] [102] [102] Cox Стимуляция транскрипции Demasi et al.2004 г.; AQP1 Стимуляция транскрипции [103] AQP3 Стимуляция транскрипции Hoogewijs et. 2016 AQP5 Транскрипционная репрессия [34] AQP9 Неясный механизм Castro-P. 2013

Nox: НАДФН-оксидаза; NOS: синтаза оксида азота; ХО: ксантиноксидаза; МАО: моноаминоксидаза; HO: гемоксигеназа; LOX: липоксигеназа; ЦОГ: циклооксигеназа; AQP: аквапорин.

Влияние O ₂ на специфическую активность (на основе значений K _m (O ₂ )) по сравнению с уровнями O ₂ — потребление белков (на основе активации транскрипции) будет иметь тенденцию противодействовать друг другу, хотя наши измерения более высоких скоростей клеточной продукции АФК при 18% O ₂ по сравнению с 5% O ₂ предполагают, что они не отменяются. Неясно, в какой степени комбинированное воздействие среды O ₂ на острый метаболический поток через различные пути потребления O ₂ и регуляцию транскрипции посредством активации HIF-1/2 белков, входящих в их состав, повлияет на физиологию клеток.Действительно, кажется невозможным предсказать, как гипероксия клеточной культуры повлияет на многочисленные O ₂ -чувствительные, O ₂ -потребляющие метаболические реакции в целом, учитывая эти сопутствующие изменения специфической активности и экспрессии.

1.10. Выводы

В стандартных условиях культивирования клеток уровни среды O ₂ обычно ~18% являются гипероксическими по сравнению с 1–6%, характерными для большинства клеток млекопитающих in vivo (таблица 1). Это несоответствие имеет важные последствия для точного моделирования физиологии клеток in vivo , поэтому важно иметь полное представление о том, как O ₂ влияет на конкретные процессы, продуцирующие ROS/RNS. Хотя скорость образования АФК в результате митохондриального дыхания относительно нечувствительна к увеличению уровня O ₂ с 5% до 18% O ₂ , многие широко распространенные клеточные ферменты, потребляющие O ₂ , очень чувствительны в том же диапазоне. В частности, активность Nox4, nNOS, eNOS и обеих изоформ МАО сильно индуцируется при более высоких уровнях O ₂ . Таким образом, эти ферменты будут продуцировать значительно больше ROS/RNS, потенциально влияя на состояние внутриклеточных сигнальных путей и последующие события, которые они регулируют.Маловероятно, что это будет подходящей отправной точкой для наложения дополнительных стрессов и ожидания «нормальной» физиологической реакции, которая имитирует контекст in vivo .

В дополнение к острому влиянию O ₂ на поток через специфические метаболические пути, есть доказательства того, что хроническое воздействие гипероксии клеточной культуры также влияет на экспрессию Nox, NOS, МАО и других O ₂ — потребляющих ферменты (табл. 5). Предположительно, это гомеостатический механизм настройки этих реакций на доступность O ₂ .Однако он снова устанавливает исходное состояние, которое может не точно моделировать состояние in vivo . Даже на проницаемость клеточных мембран для H ₂ O ₂ , NO или O ₂ может влиять O ₂ -опосредованная регуляция транскрипции AQP, учитывая их роль в облегчении диффузии этих молекул (табл. 5).

Специфические эффекты O ₂ на клеточную продукцию ROS/RNS, описанные выше, указывают на важность культивирования клеток при физиологически соответствующих уровнях O ₂ .В большинстве случаев это требует понижения уровня свободного пространства инкубатора O ₂ . Однако это может вызвать перицеллюлярную и внутриклеточную гипоксию, в зависимости от плотности клеток и скорости митохондриального дыхания. Следовательно, дополнительно необходимо контролировать перицеллюлярные уровни O ₂ и принимать меры для поддержания их в пределах физиологически значимого диапазона. Мы обнаружили, что постоянные градиенты O ₂ от верхней части столбца среды к перицеллюлярной области присутствуют в ненарушенной клеточной культуре и что регулярное мягкое перемешивание (например,г., через коромысло) может отменить их. Наше простое решение этой проблемы будет представлено в следующей публикации.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

исследование насыщения гемоглобина кислородом за счет обратного рассеяния одиночных эритроцитов

1.

Введение

Капиллярные сети поддерживают функцию биологических тканей, снабжая их кислородом и питательными веществами и удаляя метаболические отходы.В свою очередь, метаболические потребности тканей могут вызывать ремоделирование капиллярной сети. Локальные уровни кислорода играют решающую роль в опосредовании этих взаимоотношений между капиллярами и тканями; например, неоваскуляризация сетчатки при диабетической ретинопатии и ангиогенез во время развития опухоли индуцируются локальной гипоксией. В локальной микросреде кислород выгружается из гемоглобина и свободно диффундирует из эритроцитов (эритроцитов) в ткани в соответствии с градиентом парциального давления кислорода (pO2). В капиллярах pO2 определяет насыщение кислородом (sO2) гемоглобина эритроцитов.Таким образом, измерение капиллярного sO2 может косвенно оценить локальную оксигенацию тканей и метаболическую функцию. Из-за его критической важности было разработано несколько неинвазивных и немаркированных методов для визуализации микрососудистых сетей в различных участках ткани, таких как оптическая когерентная томография (ОКТ), ангиография, ^{1 – 5} лазерная сканирующая офтальмоскопия с адаптивной оптикой ( AOLSO), ^{6 – 9} лазерная спекл-ангиография, ^{10 – 13} и однократная фотоакустическая (ФА) флоуоксиграфия эритроцитов (FOG). ¹⁴ Кроме того, ОКТ и AOLSO использовались для визуализации капилляров, а PA-FOG — для визуализации капилляров sO2. Однако полностью оптическая оксиметрия для измерения sO2 в капиллярах еще не была продемонстрирована из-за сложностей, связанных с дискретным характером клеточного потока через капилляр. До сих пор неясно, возможна ли точная безметочная оптическая оксиметрия для измерения sO2 в крови на капиллярном уровне.

Фундаментальное отличие почти всей оптической оксиметрии без меток возникает из-за различных спектров оптического поглощения оксигенированного гемоглобина (HbO2) и деоксигенированного гемоглобина (Hb).Гемоглобин заполняет эритроциты, а геометрия клеток создает разрыв показателя преломления между плазмой и гемоглобином, который рассеивает свет. Это рассеяние света зависит как от геометрии, так и от оптического поглощения на основе соотношений Крамерса – Кронига. ¹⁵ Хотя этот механизм хорошо охарактеризован и изучен для цельной крови, он далеко не ясен на капиллярном уровне, где эритроциты проходят в один ряд. ¹⁵ Спектр рассеяния от одного эритроцита сильно зависит от его геометрии, ориентации и размера. Поэтому сложно оптически точно измерить sO2 на капиллярном уровне, не зная влияния геометрии, ориентации и размера на рассеяние эритроцитов. ¹⁶

Насколько нам известно, мы впервые демонстрируем возможность безметочной оптической оксиметрии по обратно рассеянному свету эритроцитов, учитывая геометрию клеток, ориентацию и изменение размера. Мы фокусируемся на обратном рассеянии света, поскольку в большинстве методов оптической визуализации in vivo используется эпи-освещение и обнаружение сигналов в обратном направлении.Для расчета спектров обратного рассеяния эритроцитов мы применили борновское приближение первого порядка ¹⁷ из-за его простой аналитической формы и свободы реализации произвольных геометрий. Существуют и другие численные модели, имитирующие оптические свойства эритроцитов, такие как Т-матрица и временная область конечных разностей, ^{18 , 19} , но они ограничены в точности клеточной геометрии и вычислительной эффективности при усреднении по многим ориентациям эритроцитов. Чтобы подтвердить наш подход, мы сравнили борновское приближение первого порядка с теорией Ми для большой мягкой сферы, похожей на RBC.Далее мы экспериментально проверили нашу модель на оксигенированных и деоксигенированных эритроцитах с помощью оптической когерентной томографии в видимом свете (vis-OCT). ³ Мы пришли к выводу, что кислородзависимый контраст поглощения гемоглобина присутствует при усреднении спектров обратного рассеяния эритроцитов по ориентации и размеру клеток, и этот контраст существенно не меняется ни при изменении среднего содержания клеточного гемоглобина (MCHC), ни при изменении деформированный. Это перспективно для проведения оптической оксиметрии на основе обратного рассеяния in vivo на капиллярном уровне с использованием vis-OCT для измерения локального капиллярного sO2 для ранней диагностики, мониторинга прогрессирования и оценки лечения рака и особенно диабетической ретинопатии.В настоящее время не существует методики измерения sO2 в капиллярах сетчатки, и стандартом лечения в офтальмологии является ОКТ.

2.

Теория

2.1.

Теоретическая модель для капиллярной оптической оксиметрии

Эритроциты, или дискоциты, представляют собой двояковогнутые дисковидные клетки, содержащие гемоглобин. Комплексный показатель преломления гемоглобина, n=n’+in», зависит от sO2, как и рассеяние света, создаваемое геометрией эритроцитов. ¹⁵ Для количественного исследования спектров обратного рассеяния эритроцитов рассмотрим световую волну с единичной амплитудой, распространяющуюся в направлении s0 и встречающую эритроциты в плазме.Для любой точки r в дальней зоне процесс рассеяния порождает сферическую волну Es(r), распространяющуюся в направлении s=r/r, где r=|r|. Это можно записать следующим образом:

Ур. (1)

экв. (2)

Дифференциальное сечение рассеяния определяется как

Ур. (3)

Мы используем σs(−s0,s0) для представления спектра обратного рассеяния эритроцитов и |s×(s×e(i))|s=−s0=1. Кроме того, мы предполагаем, что эритроциты гомогенны в пределах своих границ, таким образом,

экв. (4)

Уравнение (4) дает спектр обратного рассеяния одной отдельной ячейки с фиксированной ориентацией.Мы предполагаем, что эритроциты имеют случайную ориентацию в крови, поэтому спектр обратного рассеяния одной случайно ориентированной клетки определяется усреднением σs(−s0,s0) по равномерно распределенным направлениям падения

Ур.

Рис. 1

Расчет F{R( r)} для одного эритроцита.

Чтобы охарактеризовать внутреннюю изменчивость размеров эритроцитов, мы измерили размеры эритроцитов in vitro из коровьей крови с антикоагулянтом. Эритроциты формировали в изоволюметрических сферах с помощью 0,03% додецилсульфата натрия (SDS) в фосфатно-солевом буфере (PBS) и пипеткой наносили на предметное стекло. ²⁰ Радиус сферических эритроцитов был количественно определен по двумерным (2-D) изображениям, полученным при помощи микроскопа в светлом поле (Leica, 40×). Подробная подготовка образца описана в гл. 3.2. Микроскопическое изображение сферических эритроцитов показано на вставке на рис.2. Радиус сферических эритроцитов крупного рогатого скота примерно соответствует распределению Гаусса со средним значением 2,63   мкм и коэффициентом вариации (CV) 5,54%. CV определяется как стандартное отклонение, деленное на среднее значение. Радиус сферических эритроцитов человека, измеренный тем же методом, также примерно соответствовал распределению Гаусса со средним значением 3,03  мкм и CV 5,26%, как показано на рис. 9 в Приложении. Поскольку сферичность эритроцитов была изоволюметрической, мы приблизились к размеру ( или объем) распределение нормальных эритроцитов, как и у сферических эритроцитов, охарактеризованных под микроскопом.

Рис. 2

Распределение по радиусу сферических бычьих эритроцитов. Синие столбцы: функция массы вероятности радиуса ячейки. Кривая: Гауссово распределение (среднее: 2,63  мкм и CV: 5,54%). Сферические эритроциты получали путем добавления в кровь 0,03% SDS (соотношение: 3∶1). Панель-вставка: микроскопическое изображение сферических эритроцитов. Масштабная линейка: 10  мкм.

Принимая во внимание размер ячейки, спектр обратного рассеяния эритроцитов определяется путем усреднения σb по размеру

Ур.

2.2.

Геометрическая модель эритроцитов

Геометрическая функция нормальных дисковидных эритроцитов или дискоцитов основана на эллиптических функциях Якоби. ²¹ Для учета деформаций эритроцитов в кровотоке и особенно в капиллярах параметры геометрической функции дискоцитов были изменены для получения шести типов деформированных эритроцитов, включая стоматоциты I, стоматоциты II, стоматоциты III и сферостоматоциты в кровотока, пулевидного и парашютного типа в капиллярах. ²¹ Геометрия эритроцитов является входными данными для моделирования теоретической модели.

2.3.

Показатели преломления эритроцитов и плазмы

В моделировании мы использовали комплексные показатели преломления эритроцитов, оксигенированных и деоксигенированных. Мы предполагаем, что эритроциты внутренне гомогенны и заполнены раствором гемоглобина. Используя соотношение Крамерса-Кронига, мы получили комплексный показатель преломления эритроцитов в соответствии с коэффициентом поглощения гемоглобина, который рассчитывается из табличного молярного коэффициента экстинкции гемоглобина в воде. ²² Поскольку содержание гемоглобина в эритроцитах обычно составляет от 300 до 360  г/л, мы использовали 330  г/л при расчете показателей преломления эритроцитов. ²³ Показатель преломления плазмы, который мы использовали, равен 1,35. ²⁴

3.

Методы и материалы

3.1.

Система оптической когерентной томографии в видимом свете

Мы использовали спектральную ОКТ, оптическую технику, которая исследует структуру ткани с помощью обратно рассеянного света, для экспериментальной проверки нашей модели дискоцитов.Спектроскопический анализ с vis-OCT может предоставить спектральную информацию с пространственным разрешением, позволяющую извлекать спектры обратного рассеяния из отдельных эритроцитов. Самодельная виз-ОКТ, используемая в этом исследовании, включает в себя лазер суперконтинуума для широкополосного освещения и спектрометр, охватывающий диапазон длин волн от 520 до 630 нм. Поперечное и осевое разрешение системы vis-OCT составляют 15 и 1,7  мкм соответственно. Подробное описание системы vis-OCT дано в [1]. 3.

Для измерения эритроцитов использовался следующий протокол сканирования.На оси быстрого сканирования каждое изображение В-скана состояло из 512 А-линий, покрывающих длину 0,55 мм. По оси медленного сканирования требовалось 512 B-сканов, чтобы охватить диапазон 0,55 мм. Лазерное пятно перемещается вдоль оси быстрого сканирования, в то время как A-линии получаются с частотой 50 кГц, сканируя взад и вперед между соседними B-сканами, поэтому общее время завершения одного сканирования vis-OCT составляет примерно 5,24 с. Несмотря на то, что поперечное разрешение недостаточно высокое, чтобы различать мелкие детали отдельных эритроцитов с типичной длиной длинной оси около 8  мкм, мы смогли идентифицировать и извлечь спектр из отдельных эритроцитов. Это возможно по двум причинам. Во-первых, в наших экспериментах эритроциты взвешены редко. В соответствии с объемом обнаружения (0,55×0,55×3,02  мм3), концентрацией образца (1%), гематокритом (0,4) и размером эритроцитов, характеризуемым микроскопом, среднее расстояние между двумя эритроцитами в образце составляет приблизительно 26,7  мкм, что намного больше, чем разрешение изображения. Во-вторых, наш протокол сканирования имеет передискретизацию в поперечном направлении, в результате чего расстояние между соседними плоскостями сканирования составляет 1,07  мкм, чтобы плотность выборки была достаточной для различения отдельных эритроцитов.Таким образом, мы все еще можем дифференцировать отдельные эритроциты с помощью виз-ОКТ на рис. 4(b). Кроме того, для случаев in vivo из , когда эритроциты расположены ближе друг к другу, спектры обратного рассеяния, измеренные с помощью ОКТ, усредняются по множеству отдельных эритроцитов.

3.2.

Подготовка образцов

Образец сферических эритроцитов готовили для измерения распределения клеток по размерам. Образец готовили, сначала добавляя 0,03% раствор SDS PBS к бычьей крови (Quad Five) при объемном соотношении 3∶1.Затем эту смесь разбавляли до конечной концентрации 1% (кровь крупного рогатого скота составляла 1% от всего объема образца) путем добавления большего количества PBS. Каплю образца помещали на предметное стекло, а затем визуализировали с помощью светлопольного микроскопа (Leica, 40×). Радиус сферических эритроцитов определяли количественно по двумерным микроскопическим изображениям.

Оксигенированные и дезоксигенированные образцы эритроцитов помещались в стеклянные чашки Петри для измерения спектров обратного рассеяния методом виз-ОКТ. Каждая стеклянная чашка Петри содержала примерно 10 мл раствора образца.Для насыщенных кислородом образцов бычью кровь подвергали воздействию воздуха в течение 1 часа перед разбавлением до 1 % в PBS. Для дезоксигенированных образцов 10% дитионита натрия (Na2S2O4) в PBS добавляли к крови крупного рогатого скота в соотношении 3∶1 перед тем, как кровь разбавляли до 1% в PBS. Чтобы убедиться, что образцы полностью насыщены кислородом или деоксигенированы, для независимого измерения рО2 использовали коммерческий кислородный зонд (MI-730, Microelectrodes, Inc.). ²⁵ Для диспергирования эритроцитов в суспензии каждый образец перед измерением полностью встряхивали.Для дезоксигенированных образцов каждое измерение проводилось в течение 10 минут после приготовления с Na2S2O4, чтобы избежать оксигенации из-за воздействия воздуха.

3.3.

Обработка данных

Спектры обратного рассеяния эритроцитов были получены методом обратного преобразования Фурье — краткосрочного преобразования Фурье. ²⁶ Для каждого образца крови было получено семь независимых виз-ОКТ (0,55×0,55×3,02  мм3). В каждом сканировании vis-OCT алгоритм на основе порога использовался для сегментации областей, содержащих эритроциты, и спектры из всех этих областей усреднялись для извлечения среднего спектра.После этого каждый средний спектр был нормализован по его максимальному значению, и семь независимых средних спектров из одного и того же образца были дополнительно усреднены для получения окончательного спектра со стандартным отклонением.

4.

Результаты

4.1.

Проверка модели с помощью теории Ми

Сначала мы проверили правильность борновского приближения первого порядка, использованного при выводе этой модели. Мы сравнили спектры обратного рассеяния, рассчитанные по нашей модели и по теории Ми одиночной однородной сферы со слабым контрастом показателя преломления по отношению к фону.Радиус сферы составлял 2,25  мкм, что сравнимо с размером эритроцита. Показатели преломления шара и фона составили 1,391 и 1,35 соответственно, что близко к показателям эритроцитов и плазмы. На рис. 3(а) спектры обратного рассеяния, зависящие от геометрии, рассчитанные обоими методами, демонстрируют схожие колебательные характеристики, вызванные интерференцией света, отраженного от верхней и нижней границ одной сферы. Это сходство подтверждает борновское приближение первого порядка для расчета спектров обратного рассеяния больших мягких сфер, подобных эритроцитам.Затем мы применили комплексный показатель преломления HbO2 и Hb к сферам с одинаковым радиусом, чтобы рассчитать их спектры обратного рассеяния с помощью нашей модели и теории Ми. Подобный колебательный характер, показанный на рис. 10 в Приложении, по-прежнему преобладает в спектрах обратного рассеяния, что затрудняет различение контраста поглощения гемоглобина. Однако, когда мы усреднили спектры по размеру в соответствии с распределением Гаусса (среднее: 2,25  мкм; CV: 6%), спектры, зависящие от геометрии, сгладились, и отчетливо проявился контраст поглощения.Чтобы подтвердить этот контраст, мы также рассчитали спектры по теории Ми для сравнения. Результаты обоих методов демонстрируют схожий контраст поглощения гемоглобина на рис. 3(b), подтверждая осуществимость нашей модели и указывая на возможность получения зависимого от поглощения sO2 из обратного рассеяния на клеточном уровне.

Рис. 3

Нормированные спектры обратного рассеяния по теории Ми и нашей модели для сфер: (а) равномерный радиус: 2,25  мкм; показатель преломления: 1,391; (б) средний радиус: 2.25  мкм; CV: 6%; показатель преломления: комплексный показатель преломления HbO2 и Hb. Показатель преломления фона: 1,35.

4.2.

Проверка модели с помощью оптической когерентной томографии в видимом свете

Наша модель использовалась для моделирования спектров обратного рассеяния дискоцитов с различной оксигенацией. Затем мы использовали vis-OCT для экспериментальной проверки нашей модели дискоцитов путем измерения спектров обратного рассеяния подготовленных оксигенированных и деоксигенированных образцов крови. Двухмерное поперечное сечение и трехмерная (3D) конфигурация дискоцита показаны на рис.4(а). Предполагалось, что дискоциты имеют тот же средний объем, что и эритроциты, сферические с помощью SDS, поэтому их размеры также примерно соответствуют распределению Гаусса (средняя длина длинной оси: 7,5   мкм; CV: 6%). Результаты моделирования оксигенированных и дезоксигенированных эритроцитов показаны на рис. 4(c)–4(d), что указывает на аналогичный контраст с поглощением гемоглобина. Для проверки оксигенации образца был использован коммерческий кислородный зонд для измерения pO2 в оксигенированных и деоксигенированных образцах крови, которые составляли 147,16 ± 5,04   мм мм рт. ст. и 0.342±0,129  мм рт. ст., что соответствует значениям sO2 98,87±0,35% и приблизительно 0% соответственно. В-визуальное ОКТ-сканирование взвешенных эритроцитов показано на рис. 4(b). Спектры оксигенированных и деоксигенированных эритроцитов со стандартными отклонениями представлены на рис. 4(в)–4(г). При каждом сканировании vis-OCT от 1000 до 2000 эритроцитов сегментировали для усреднения спектров обратного рассеяния. Для сравнения показаны спектры обратного рассеяния, рассчитанные по теории Ми для сферических эритроцитов равного объема. Все результаты нормированы по их максимальным значениям соответственно.

Результаты нашей модели, теории Ми и экспериментов показывают аналогичный контраст поглощения на рис. 4(в)–4(г) без осцилляций. По сравнению с теорией Ми результаты нашей модели по величине ближе к экспериментам, особенно для деоксигенированных образцов. Хотя результаты теории Ми показывают больший контраст, особенно для насыщенных кислородом образцов, они не находятся в пределах погрешности экспериментов. Это говорит о том, что геометрия ячейки влияет на ее спектр обратного рассеяния, и наша модель может служить более точным методом для расчета спектров обратного рассеяния несферических частиц.

Рис. 4

(а) Геометрия дискоцита. (b) Псевдоцветное B-сканирование эритроцитов в PBS с помощью vis-OCT. Горизонтальные и вертикальные масштабные линейки: 100  мкм. Нормализованные спектры обратного рассеяния (c) насыщенных кислородом и (d) дезоксигенированных дискоцитов по данным vis-OCT и нашей модели (средняя длина длинной оси: 7,5  мкм, CV: 6%) и сфер равного объема по теории Ми (средний радиус: 2,625  мкм , CV: 6%).

4.3.

Моделирование эритроцитов с различным средним содержанием клеточного гемоглобина

Мы рассчитали показатели преломления эритроцитов для моделирования на основе постоянного MCHC, равного 330  г/л, но практически этот MCHC может варьироваться от 300 до 360  г/л, что приводит к вариации показателей преломления эритроцитов. ²³ Таким образом, мы исследовали, как изменение MCHC влияет на спектры обратного рассеяния эритроцитов, установив MCHC равным 300, 320, 340 и 360  г/л соответственно. Спектры обратного рассеяния эритроцитов рассчитывались при различных MCHC и усреднялись по ориентации и размеру. Результаты показаны на рис. 5. Контраст оксигенации в спектрах обратного рассеяния эритроцитов сохраняется при различных MCHC, но более высокий MCHC имеет тенденцию генерировать спектры обратного рассеяния с более интенсивным контрастом оксигенации. Это демонстрирует целесообразность использования 330  г/л в качестве MCHC для всех наших симуляций.

Рис. 5

Влияние MCHC на спектры обратного рассеяния эритроцитов.

4.4.

Моделирование деформированных эритроцитов

Эритроциты в кровотоке могут деформироваться под действием упругих и электрических сил, поверхностного натяжения и осмотического или гидростатического давления. ²¹ В частности, эритроциты могут принимать форму пули или парашюта при прохождении через капилляры. ^{27 , 28} Для учета этого мы исследовали влияние деформации клеток в капиллярах на спектры обратного рассеяния. Для сравнения также исследуются четыре общие деформации эритроцитов в кровотоке. Шесть деформаций эритроцитов, включая пулевидную (l=5,35  мкм, h+=4,125  мкм, h−=1,375  мкм, m+=0,12, m−=0,35) и парашютную (l=5,525  мкм, h+=4,55  мкм, h− =0,15  мкм, m+=0 и m−=0,99) в капиллярах, а также стоматоциты I типа (l=7,8  мкм), стоматоциты II (l=6,525  мкм), стоматоциты III (l=6,025  мкм) и сферо-стоматоциты (l = 5,825  мкм) в кровотоке, ²¹ , которые имеют одинаковый средний объем, были входными данными для моделирования модели.Их двумерные поперечные сечения и трехмерные конфигурации показаны в левом верхнем углу рис. 6(а)–6(е). Размеры всех деформаций соответствовали распределению Гаусса (CV: 6%). Сравним их спектры обратного рассеяния на рис. 6(a)–6(f), где все кривые нормированы по максимальным значениям оксигенированных эритроцитов соответственно. Все контрасты одинаковы, что указывает на то, что спектры обратного рассеяния, показывающие контраст поглощения гемоглобина, существенно не различаются для эритроцитов с различной деформацией.

Рис. 6

Геометрия деформированных эритроцитов и их спектры обратного рассеяния, рассчитанные по нашей модели: (а) пулевидный тип, (б) парашютный тип, (в) стоматоциты I типа, (г) стоматоциты II типа, (д) стоматоцит типа III и (е) сферостоматоцит.В каждом случае выделены только кривые для геометрии в верхнем левом углу, тогда как остальные полупрозрачны.

5.

Обсуждение

Результаты моделирования спектров обратного рассеяния эритроцитов усредняются как по ориентации клеток, так и по размеру, но изменение размера клеток является ключом к выявлению контраста поглощения гемоглобина в спектрах обратного рассеяния эритроцитов. Для одного эритроцита интерференция отраженного света от его поверхностей рассеяния приводит к колебательному спектру обратного рассеяния, который зависит от эффективной толщины клетки и длины волны освещения.Эта эффективная толщина тесно связана с ориентацией и размером эритроцитов. Отдельные эритроциты с тремя различными ориентациями по отношению к падающему свету имеют разные спектры обратного рассеяния, показанные на рис. 7(а)–7(в). Когда мы берем среднее значение толщины эритроцитов по ансамблю по всем направлениям падения, колебательные спектры обратного рассеяния по-прежнему превосходят спектральный контраст оксигенации, показанный на рис. 7 (d). Однако, когда мы дополнительно усредняем спектры по размерам ячеек с гауссовым распределением с достаточно большим CV, колебательные спектры для каждого отдельного размера сглаживаются.Это сглаживание выявляет основные профили поглощения по мере усреднения колебаний, оставляя отчетливый контраст, зависящий от sO2. Влияние CV на спектры обратного рассеяния сферических эритроцитов по теории Ми показано на рис. 11 в Приложении.

Рис. 7

Спектры обратного рассеяния оксигенированных или деоксигенированных эритроцитов при различных направлениях падения света. Направление падения света параллельно плоскости диска клетки на (а), перпендикулярно плоскости диска клетки на (б) и под углом 45 градусов к плоскости диска клетки на (в).Спектры обратного рассеяния эритроцитов на (d) усреднены по всем направлениям падения. [Длина длинной оси эритроцитов в (а)–(в): 7,5  мкм; Длина длинной оси эритроцитов в (d): 7,5  мкм].

Капиллярный sO2 можно количественно определить по контрасту в спектрах обратного рассеяния эритроцитов, усредненных по ориентации и размеру клеток, но невозможно измерить оксигенацию отдельного эритроцита с помощью его оптического спектра обратного рассеяния из-за его высокой чувствительности к клеточной ориентации. На самом деле, для будущих капиллярных измерений in vivo спектры обратного рассеяния эритроцитов, измеренные с помощью vis-OCT, будут усредняться по времени для заданного местоположения и/или по заданной области, содержащей капиллярные сети, чтобы получить достоверное измерение усредненного sO2.Кроме того, sO2, определенный таким образом, более надежен для оценки местной оксигенации тканей, чем sO2 отдельных эритроцитов. Например, локальная гипоксия при диабетической ретинопатии и раке отражается sO2 локальной капиллярной сети, а не sO2 отдельных эритроцитов, проходящих через капилляр. Для необходимого среднего количества эритроцитов, чтобы показать контраст оксигенации в спектрах обратного рассеяния, мы сегментировали от 1000 до 2000 эритроцитов для каждого сканирования vis-OCT. Минимальное количество эритроцитов, которое необходимо усреднить, чтобы увидеть контраст оксигенации, составляет 147 ± 3, при условии, что значение p равно 0.05 для различения различных спектральных характеристик между оксигенированными и деоксигенированными эритроцитами. Чтобы гарантировать, что в будущем будет усреднено достаточное количество эритроцитов в капиллярных измерениях in vivo , можно многократно сканировать поперечные срезы капилляров или сканировать небольшую область, содержащую ложе капилляров с достаточным количеством клеток крови для усреднения. Принимая скорость капиллярного потока за 0,65  мм/с, ²⁹ плотность капилляров за 112  капилляров/мм2, ³⁰ размер эритроцитов за 8  мкм, гематокрит крови за 0.4, и 512 A-линий в каждом B-скане для диапазона 0,55 мм, получение 147 эритроцитов в слое кожи толщиной 1 мм потребует непрерывного времени сбора данных 38 с или, в качестве альтернативы, сканирование общего объема кожи 0,16× 0,16×1  мм3. Такой метод был бы экспериментально осуществим для применений in vivo .

Физиологически ориентация эритроцитов в капиллярах зависит от направления потока, поэтому мы исследовали, как ориентация клеток влияет на их спектры обратного рассеяния в капиллярах, и обнаружили, что ориентация клеток в капиллярах мало влияет на выявление контраста оксигенации гемоглобина в спектрах обратного рассеяния.В этом случае мы предполагаем, что направление капиллярного потока перпендикулярно падающему свету, а большинство ориентаций клеток осесимметричны относительно этого направления потока (± π/18). Это наиболее распространенная ориентация изображения на основе обратного рассеяния. Размеры ячеек также распределены по Гауссу (CV: 6%). Полученные спектры обратного рассеяния эритроцитов пулеобразного и парашютного типа на рис. 8 по-прежнему демонстрируют аналогичный контраст, что указывает на небольшое влияние ориентации клеток на спектры обратного рассеяния в капиллярах. Собственно, за счет капиллярной направленности и эластичности, взаимодействия эритроцитов с другими клетками крови и т. д., распределение ориентации эритроцитов в капиллярах трудно предсказать. ^{31 , 32} Без явного знания ориентации более расслабленное состояние (равномерно распределенные ориентации ячеек) интуитивно возможно.

Рис. 8

Двумерные сечения и трехмерные конфигурации деформированных эритроцитов в капиллярах и их спектры обратного рассеяния по нашей модели: (а) пулевидного типа и (б) парашютного типа. Спектры обратного рассеяния усредняются по одинаковым ориентациям ячеек (+/- π/18) и размерам ячеек, распределенным по Гауссу (CV: 6%).

Расхождения между измерениями vis-OCT и нашей моделью для дискоцитов можно объяснить отклонениями истинной геометрии клеток от нашей геометрической модели и исключением рассеяния более высокого порядка в борновском приближении первого порядка. Тем не менее, наш метод требует получения сигналов от эритроцитов с течением времени для данного местоположения и / или по данной области, содержащей капиллярные сети, чтобы обеспечить усреднение ансамбля по различным ориентациям и размерам, что неизбежно, поскольку эритроциты проходят через капилляр. Таким образом, наши результаты демонстрируют осуществимость оптической оксиметрии, основанной на обратном рассеянии света на капиллярном уровне. Для будущих измерений in vivo с помощью виз-ОКТ мы можем получить две калибровочные кривые, спектры обратного рассеяния оксигенированных и деоксигенированных эритроцитов с помощью виз-ОКТ и количественно определить sO2 экспериментальных спектров обратного рассеяния в соответствии с калибровочными кривыми посредством подгонки методом наименьших квадратов.

6.

Заключение

Подводя итог, мы предлагаем теоретическую модель для оксиметрии на основе обратного рассеяния на уровне одного капилляра, которая ранее не исследовалась теоретически.Эта модель была проверена теорией Ми и экспериментами с использованием виз-ОКТ. Спектры обратного рассеяния, рассчитанные с помощью этой модели, демонстрируют четкий контраст поглощения гемоглобина при учете изменений в ориентации и размере клеток, что позволяет охарактеризовать sO2 эритроцитов. Это перспективно для оптической оксиметрии in vivo на основе обратного рассеяния на уровне одного капилляра для измерения локального капиллярного sO2 для ранней диагностики, мониторинга прогрессирования и оценки лечения диабетической ретинопатии и рака.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии других соответствующих конфликтов интересов в этой статье.

Приложения

Приложение

Рисунки 9–11 являются дополнительными.

Рис. 9

Распределение по радиусу сферических эритроцитов человека. Синие столбцы: функция массы вероятности радиуса ячейки. Кривая: распределение Гаусса со средним значением 3,03  мкм и CV 5,26%. Сферические эритроциты получали путем добавления 0,03% SDS (в PBS) к крови в соотношении 3∶1.Панель-вставка: микроскопическое изображение сферических эритроцитов. Масштабная линейка: 10  мкм.

Рис. 10

Сравнение нормированных спектров обратного рассеяния, рассчитанных по теории Ми и нашей модели для сфер (сферических эритроцитов) с однородным радиусом 2,25  мкм. Показатель преломления сфер: комплексный показатель преломления HbO2 и Hb. Показатель преломления фона: 1,35.

Рис. 11

Влияние CV на спектры обратного рассеяния сферических оксигенированных и дезоксигенированных эритроцитов со средним радиусом 2.3  мкм по теории Ми. CV: (а) 0,1%, (б) 0,5%, (в) 1%, (г) 1,5%, (д) ​​2% и (е) 5%.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения в рамках грантов № R01CA183101, R01CA173745 и R01CA156186; Национальный научный фонд по грантам № CBET-1240416 и CBET-1055379; и Медицинский фонд Эванса. Мы благодарим Quyen Nguyen, Andrew J. Radosevich, Di Zhang, Aya Eid, Xiao Shu, Benjamin D. Keane, Yue Li и Adam Eshein за обсуждения и исправления.

Ссылки

3. 

4.

7. 

8.

9.

16. 

19. 

23. 

25. 

26. 

29. 

Биографии авторов отсутствуют.

Оценка насыщения кислородом гемоглобина микроциркуляторного русла кожи и фракции ткани эритроцитов с использованием мультиспектральной системы моментальной визуализации: проверочное исследование

1.

Введение

В тканевой микроциркуляции участвуют мельчайшие сосуды кровеносной системы: сеть капилляров, которые снабжают клетки организма кислородом и питательными веществами и одновременно удаляют продукты жизнедеятельности, образующиеся в результате клеточного дыхательного цикла. Когда доставка крови или клеточное поглощение кислорода серьезно нарушены, в пораженной области вскоре обнаруживается клеточная недостаточность. Аномалии в распределении на локальном микроциркуляторном уровне могут выявить ранние признаки болезни по таким параметрам, как уровень насыщения гемоглобина кислородом и тканевая фракция эритроцитов (эритроцитов). ¹ Исходные значения могут раскрывать важную физиологическую информацию, но чаще способность системы кровообращения адаптироваться к естественным или индуцированным раздражителям оценивается в клинических условиях. Протоколы «стимул-реакция» выявляют способность микроциркуляторной системы сужать или расширять сосуды и тем самым регулировать кровоток, чтобы адаптироваться к периодам ишемии или провокации нагреванием. ^{2 – 5}

Окси- и дезоксигемоглобин, обнаруженные в эритроцитах, являются сильными поглотителями в видимом диапазоне длин волн в тканях человека с уникальными спектральными отпечатками.Количество окси- и дезоксигемоглобина можно оценить с помощью спектроскопии диффузного отражения (DRS) для изучения насыщения гемоглобина кислородом и фракции ткани эритроцитов. DRS использует широкополосный источник света для облучения тканей. Фотоны, проникающие в ткани, взаимодействуют со структурами и хромофорами посредством процессов рассеяния и поглощения. Фотоны обратного рассеяния, которые обнаруживаются и разрешаются спектрально, таким образом, несут информацию о составе ткани. В зависимости от геометрии волоконно-оптического зонда или системы визуализации необходимо применять разные модели переноса фотонов, чтобы распутать эту информацию.Упрощенные однородные или слоистые модели тканей в сочетании с теорией диффузии или моделированием методом Монте-Карло можно использовать для разложения измеренного сигнала DRS. ⁶

Мультиспектральная визуализация (MSI) и гиперспектральная визуализация (HSI) — это методы, основанные на DRS, которые позволяют получать 2D-изображения, содержащие спектральную информацию о каждом пикселе, создавая набор 3D-данных, т. е. куб данных. Получение кубов данных обычно выполняется либо путем сканирования по измерению длины волны (спектральное сканирование), либо по пространственному измерению (пространственное сканирование).Пространственное сканирование может быть выполнено путем получения полного спектра для одного пикселя (технология веерной щетки) или для строки пикселей (технология веерной метлы), а затем сканирования интересующей области. При спектральном сканировании двумерное изображение захватывается при каждой экспозиции, что включает в себя сканирование по нескольким длинам волн. ⁷ В эксперименте по освобождению от окклюзии Bjorgan et al. ⁸ использовали систему гиперспектральной камеры с веерным сканированием на ладонной поверхности предплечья для оценки уровней насыщения кислородом на исходном уровне и через 5 минут после окклюзии.Они обнаружили систематическое различие между моделированием Монте-Карло и диффузионной моделью в оценке насыщения кислородом, подчеркнув необходимость точной модели при анализе кубов данных.

Камеры моментального снимка MSI захватывают полный куб данных (как пространственную, так и спектральную информацию) за одну экспозицию, что позволяет отслеживать временные изменения микроциркуляции. ⁹ Спектральная информация часто получается путем применения фильтров к отдельным элементам детектора или путем спектрального рассеивания света по детектору, что ограничивает как спектральные, так и пространственные размеры куба данных. ¹⁰ Детектор снимка MSI, используемый в этой работе, имеет массив фильтров Фабри–Перо с 16 фильтрами, распределенными в повторяющемся мозаичном узоре 4 × 4 по пикселям датчика. ¹¹ Оба Bauer et al. ¹² и Rubins et al. ¹³ использовал описанную фотокамеру MSI для сбора данных во время тестов на освобождение от окклюзии. Рубинс и др. измерили ладонь и сопоставили данные из 10 диапазонов длин волн с смоделированными данными с использованием модели двухслойной диффузии, в которой варьировались насыщение гемоглобина кислородом, фракция ткани эритроцитов, концентрация меланина и толщина эпидермиса. ^{13 , 14} Bauer et al. ¹² зафиксировали данные с тыльной стороны ладони и проанализировали данные об интенсивности трех спектрально скорректированных диапазонов длин волн с использованием модифицированного выражения Бера-Ламберта.

Метод Монте-Карло для легкого транспорта считается золотым стандартом, который позволяет моделировать легкий транспорт произвольной сложной геометрии за счет вычислительного времени. ⁶ Поэтому мы использовали его в нашей предыдущей работе ¹⁵ , описывающей моментальную камеру MSI, оценивающую насыщение гемоглобина кислородом и долю ткани эритроцитов в микроциркуляции кожи.В этой статье мы усовершенствовали метод, изменив процедуру нормализации белого, а также спектр поглощения гемоглобина. Кроме того, метод был применен к когорте из 24 человек, прошедших стандартизированные тесты на окклюзию сосудов с большими динамическими изменениями насыщения гемоглобина кислородом (артериальная окклюзия) и фракции ткани эритроцитов (венозная окклюзия). Работа была направлена ​​на обширную проверку in-vivo способности системы MSI количественно определять насыщение гемоглобина кислородом и относительную фракцию ткани эритроцитов, сравнивая данные MSI с данными, зарегистрированными совместно с эталонной системой на основе зондов.Эталонная система анализирует данные DRS в том же спектральном диапазоне, что и система MSI. ^{16 , 17}

2.

Материалы и методы

2.1.

Оборудование

Камера MSI моментального снимка (xiSpec MQ022HG-IM-SM4X4-VIS, XIMEA®, Германия) использовалась для получения спектральных данных диффузно рассеянного света от кожных тканей во время провокации окклюзии сосудов. Камера имеет датчик CMOS (2048 × 1088   пикселей), на который наложен массив интерференционных фильтров Фабри-Перо.Массив содержит 16 уникальных полосовых фильтров, выровненных по расположению пикселей в повторяющемся мозаичном узоре 4×4. Каждый фильтр имеет заданную спектральную характеристику в диапазоне длин волн от 450 до 650 нм, по крайней мере, с одним основным пиком в интервале от 470 до 630 нм и со значительным спектральным перекрытием между фильтрами. Камера была оснащена 16-мм объективом (объектив C Series VIS-NIR Lens, Edmund Optics Inc., Barrington).

Камера MSI была установлена ​​рядом с кольцевым фонарем (R130, Smart Vision Lights) с восемью светодиодными источниками, излучающими свет в видимом диапазоне (от 390 до 765 нм). Спектр света светодиода характеризовали с помощью спектрометра (AvaSpec-ULS2048L-RS-USB2, Avantes BV, Апелдорн, Нидерланды), откалиброванного с эталонной лампой (AvaLight-HAL-CAL-Mini, Avantes BV, Апелдорн, Нидерланды). Чтобы избежать поверхностных зеркальных отражений от освещаемой ткани, использовалась пара скрещенных поляризатор/анализатор, при этом поляризатор располагался перед кольцевым источником света, а анализатор – перед детектирующей камерой MSI.

Данные были собраны и проанализированы с помощью MATLAB (MATLAB версии 8.2.0, 2013b, компьютерное программное обеспечение, The MathWorks Inc., Натик, Массачусетс). Чтобы уменьшить шум и объем данных, камерой было сделано 16 последовательных снимков с выдержкой 20 мс каждый, а затем они были суммированы. Полученное изображение сохранялось во время записи с эффективной частотой кадров 1,4 кадра в секунду (fps).

В качестве эталона использовали прибор PF6000 EPOS на основе зонда (Perimed AB, Järfälla, Швеция). Он оценивает абсолютные значения насыщения гемоглобина кислородом (%) и фракции ткани эритроцитов (% фракции ткани) с частотой дискретизации 1 Гц. Система основана на обратном алгоритме Монте-Карло для анализа пространственно разрешенных спектров диффузного отражения, снятых при двух расстояниях между источником и детектором (0,4 и 1,2 мм) в диапазоне длин волн от 450 до 850 нм. Обратный алгоритм использует трехслойную модель ткани кожи, которая учитывает индивидуальные различия в количестве крови, насыщении крови кислородом, количестве меланина, толщине слоя и рассеянии ткани. ¹⁶ Эксперименты с фантомами показали, что система EPOS оценивает насыщение крови кислородом с точностью до 5 % (среднеквадратичное отклонение), а абсолютную долю ткани эритроцитов — с точностью до 11 % (среднеквадратичное отклонение). ¹⁸ Система EPOS была оснащена источником света AvaLight-HAL-S (Avantes, Апелдорн, Нидерланды) для 11 субъектов и заменена на AvaLight-HAL-S-Mini для последних 13 субъектов. Оба источника света излучают свет в диапазоне от 360 до 2500 нм. Наручная манжета для измерения артериального давления, используемая для окклюзии сосудов, контролировалась EPOS.

2.2.

Протоколы измерений

Для регистрации динамических изменений насыщения гемоглобина кислородом и тканевой фракции эритроцитов на ладонной поверхности предплечья здоровых добровольцев выполняли два отдельных протокола провокации (артериальная и венозная окклюзия).Левая или правая рука выбиралась случайным образом. Оба протокола были выполнены на одной руке, начиная с артериальной окклюзии. После завершения протокола артериальной окклюзии был предоставлен период отдыха продолжительностью не менее 45 минут, чтобы обеспечить минимальное влияние предыдущей провокации.

Субъект акклиматизировался в помещении в сидячем положении не менее чем за 15 минут до начала первого протокола. Рука удобно лежала на устойчивой поверхности, где вакуумная подушка (Germa Protec, AB Germa, Кристианстад, Швеция) обеспечивала поддержку и фиксацию во время измерений.Чтобы получить пространственную привязку, девять чернильных точек были помещены на ладонной поверхности предплечья, которые обозначали квадрат с четырьмя интересующими областями (ROI) размером 2×2  см (всего 4×4  см). Камера MSI располагалась на высоте 30 см над поверхностью руки, при этом точки находились в поле зрения. С помощью двойной липкой ленты датчик EPOS был зафиксирован на ладонной поверхности предплечья рядом с областью интереса, но за ее пределами, дистально по отношению к отмеченной области.

Манжета для измерения артериального давления была помещена вокруг плеча испытуемого перед началом измерений.После 5 мин исходных измерений манжету быстро надули до давления 250 мм рт.ст. (артериальная окклюзия) или 45 мм рт.ст. (венозная окклюзия) соответственно. Манжета поддерживала постоянное давление в течение 5 мин, а затем была сдута. Измерения продолжались в течение 10 минут после выпуска, чтобы зафиксировать восстановление после провокации.

2.3.

Субъекты исследования

В это исследование были включены 24 здоровых человека (11 женщин и 13 мужчин) в возрасте от 18 до 40 лет с кожей европеоидного типа, классифицированной как тип кожи от I до III (самооценка по тесту типирования кожи Фитцпатрика ¹⁹ ). Критериями исключения были известные кожные заболевания или заболевания системы кровообращения, использование лекарств, влияющих на систему кровообращения, и курение. Участников попросили воздержаться от интенсивной физической активности в течение 24 ч и кофе в течение 4 ч до измерений. От всех участников было получено письменное информированное согласие. Исследование было одобрено Региональным советом по этике в Линчепинге (D. № 2015/392-31).

2.4.

Сбор данных

Камера MSI получила данные в 1.4 кадра в секунду по всей длине каждого протокола. Система EPOS непрерывно измеряла насыщение гемоглобина кислородом и фракцию ткани эритроцитов во время тестов с частотой сбора данных 1 Гц. В системах MSI и EPOS использовались отдельные компьютеры с синхронизированными часами, что позволяло сравнивать метки времени собранных данных. В комнате было темно, за исключением светодиодного источника света, который был включен во время сбора данных. Данные калибровки в темноте при выключенном светодиодном источнике света были получены в течение трех 10-секундных периодов при t = 4, 9 и 19 минут после начала измерения для обоих протоколов окклюзии, чтобы учесть потенциальный дрейф темнового спектра во время измерения. Темные точки данных калибровки были исключены перед анализом измерений. EPOS непрерывно измерял насыщение гемоглобина кислородом и тканевую фракцию эритроцитов во время тестов.

Когда протоколы были завершены, были получены эталонные данные белого цвета для учета возможных спектральных изменений в камере и источнике света с течением времени. Белая эталонная плитка Spectralon® (Labsphere, Inc., Нью-Гемпшир) помещалась в поле зрения камеры MSI на том же расстоянии, что и поверхность предплечья.Данные были получены при включенном и выключенном источнике света на 10 с соответственно. Время интегрирования сократилось вдвое по сравнению с измерениями на ткани из-за высокой отражательной способности плитки Spectralon®.

2.5.

Предварительная обработка данных

Каждое изображение размером 2048×1088   пикселей, полученное камерой MSI, было спектрально отсортировано по 16 диапазонам/каналам длин волн, n, в результате чего был получен многоспектральный куб необработанных данных, IM(x,y,n), с 16 изображениями размером 512×272   пикселей. Обратите внимание, что IM(x,y,n) меняется со временем.Черные чернильные точки на руке использовались для отметки и отслеживания местоположения анализируемой кожи на протяжении всего протокола. На первом изображении каждой последовательности измерений приблизительное расположение точек было отмечено вручную. Затем точное местоположение для каждого записанного изображения было найдено путем маскирования области размером 16 × 16   пикселей вокруг точки и определения «центра масс» в инвертированном изображении с полосовым фильтром. Фильтрация в основном удаляла среднюю интенсивность изображения и более мелкие объекты, такие как волосы, оставляя неизменным положение точек.Найденные координаты использовались в качестве кандидатов на координаты точек в последовательном изображении, и это повторялось для всех измеренных образцов. После этого все координаты были проверены вручную и не обнаружили ложных срабатываний.

Измеренный куб данных калибровки в темноте, IdM(x,y,n), вычитался из каждого полученного куба данных. IdM(x,y,n) представлял собой линейную интерполяцию, основанную на всех трех измерениях в темноте, полученных в моменты времени t=4, 9 и 19 мин.

Данные нормализации белого были скорректированы по темноте с помощью Id,wM(x,y,n), измеренного на плитке Spectralon® при выключенном источнике света.Поскольку плитка была слишком мала, чтобы покрыть все поле зрения, данные нормализации белого от всех включенных субъектов были усреднены в один общий куб данных нормализации белого, IwM(x,y,n). Куб данных, нормализованный по белому и откалиброванный по темному, полученный из измеренных данных, INM(x,y,n), был рассчитан с использованием:

Eq. (1)

2.6.

Модель ткани и моделирование методом Монте-Карло

Алгоритм, используемый для анализа данных MSI, основан на справочной таблице с предварительно смоделированными данными Монте-Карло по переносу фотонов в двухслойной модели кожи. ²⁰ Это упрощенная модель реальной ткани кожи с однородными слоями, поэтому кровеносные сосуды или другие структуры не отображаются. Поглотители, кроме меланина и гемоглобина, также не учитываются. Модель определяется приведенным коэффициентом рассеяния µs'(λ), коэффициентом поглощения меланина µa,mel(λ) и коэффициентом поглощения кровью µa,b(λ). Коэффициенты определяются по шести параметрам: тканевое рассеяние (параметры α и β), тканевая фракция меланина (fmel), тканевая фракция эритроцитов (fRBC), насыщение гемоглобина кислородом (SO2) и толщина эпидермиса (Tepi) в соответствии с уравнениями. (25). ²¹ В нашем предыдущем исследовании ²² мы обнаружили, что во время оптимизации достаточно варьировать только fmel, fRBC и SO2. Поэтому параметры α, β и Tepi были установлены на фиксированные значения, как описано ниже.

мкс'(λ), определяемое уравнением (2), ²¹ предполагалось одинаковым для обоих смоделированных слоев. Параметры α и β были зафиксированы на уровне α=2,5  мм–1 и β=2, что сравнимо со средними значениями индивидуальных мкс’(λ), оцененных системой EPOS в этом и других исследованиях. ²³ мкс(λ) описывается фазовой функцией рассеяния Хеньи–Гринштейна в уравнении(3), ²¹ с коэффициентом анизотропии g=0,8 для всех длин волн   λ.

Экв. (2)

ур. (3)

Коэффициент поглощения был разным в двух слоях. Верхний эпидермальный слой имел толщину Tepi=125  мкм и содержал меланин, но не содержал крови. Коэффициент поглощения меланина определяли по уравнению. (4), ²¹ , где cmel может находиться в диапазоне от 0 до 0,084.

Экв. (4)

Нижний кожный слой считался бесконечно толстым и содержал кровь, но не меланин.Коэффициент поглощения крови определяли по уравнению. (5), ²¹ , где SO2  в диапазоне от 0 (ненасыщенный) до 1 (полностью насыщенный), fRBC в диапазоне от 0 до 0,056, µa,Hbis – коэффициент поглощения деоксигенированного гемоглобина, а µa,HbO2 – коэффициент поглощения оксигенированного гемоглобина . Последние два были получены путем объединения табличных данных Zijlstra и Prahl, как описано Fredriksson et al. ¹⁸

Экв. (5)

моделирования методом Монте-Карло для выбранных мкс’ и   Тепи, пока не было обнаружено 200 000 фотонов. Длина пути каждого фотона в каждом слое регистрировалась и впоследствии использовалась для добавления поглощения в соответствии с законом Бера-Ламберта (т. е. белый Монте-Карло). Полученные значения интенсивности были сохранены в справочной таблице HLUTMC(μs’, μa, mel, μa, b, Tepi). Интерполяция в наборе данных позволяет быстро генерировать смоделированные спектры диффузного отражения HMC(λ) на основе смоделированных данных со свойствами рассеяния и поглощения, изменяющимися в заданных пределах.

2.7.

Постобработка спектров, смоделированных методом Монте-Карло

Постобработка спектров, смоделированных методом Монте-Карло, необходима из-за существенного спектрального перекрытия 16 каналов длин волн камеры MSI. Ранее это было описано в Ewerlöf et al. ¹⁵ Для сравнения сгенерированного методом Монте-Карло спектра HMC(λ) с измеренным 16-канальным спектром интенсивность IMC(n), соответствующая каждому каналу, была рассчитана по уравнению. (6), где rn(λ) — чувствительность детектора камеры, указанная производителем для каждого канала, а L(λ) — выходной спектр источника света.Отклик суммируется для всех длин волн в диапазоне от 450 до 650 нм, чтобы получить общий отклик интенсивности от каждого канала. Процедура проиллюстрирована на рис. 1.

Ур. (6)

Рис. 1

Схема, описывающая, как рассчитываются смоделированные интенсивности для 16 каналов (а). Для каждого канала смоделированная интенсивность определяется путем суммирования чувствительности детектора канала (b), спектра излучения источника света (c) и сгенерированного методом Монте-Карло спектра (d) в диапазоне длин волн, как описано в уравнении.(6). Сгенерированный методом Монте-Карло спектр находится в предварительно смоделированной справочной таблице для комбинации параметров модели.

Соответствующая нормализация белого, IwMC(n), была рассчитана по уравнению. (7), используя сгенерированный спектр HwMC(λ)=1, а затем используемый в уравнении. (8) чтобы получить ответ интенсивности нормализации белого, INMC(n), для спектра, сгенерированного методом Монте-Карло.

Экв. (7)

Ур. (8)

2.8.

Обратный алгоритм Монте-Карло

Обратный алгоритм Монте-Карло ранее был описан в ссылках. 15 и 22. Каждая измеренная характеристика интенсивности от камеры MSI, INM(n), сравнивается с данными, полученными методом Монте-Карло, INMC(n), смоделированными с известными оптическими свойствами. Штрафная функция, E [уравнение. (9)], состоит из двух частей, описываемых уравнениями. (10) и (11).

Спектры, полученные методом Монте-Карло, INMC(n), сравниваются с измеренным спектром, INM(n), с использованием уравнения (10).

Экв. (10)

Для дальнейшего повышения чувствительности к насыщению гемоглобина кислородом были выбраны четыре канала длин волн из-за их высокой чувствительности в диапазоне длин волн от 540 до 580 нм, где спектры поглощения окси- и дезоксигемоглобина имеют явные различия.Соотношение между каналами было рассчитано и умножено на 10 в штрафной функции, чтобы дать члену большое влияние на расчетную ошибку. Числа в скобках в уравнении (11) обозначают длину волны основного пика канала чувствительности детектора.

Экв. (11)

Наилучшее соответствие находится путем минимизации штрафной функции E в уравнении. (9) в смысле квадратичного закона с алгоритмом, отражающим область доверия, описанным уравнением.(12).

Экв. (12)

2.9.

Статистические данные

Результаты были выполнены с помощью линейного регрессионного анализа и анализа Бланда-Альтмана. Все значения измерений с камеры MSI и EPOS были синхронизированы по времени путем сравнения абсолютных временных меток из каждой соответствующей системы и интерполяции данных EPOS для соответствия временным меткам данных MSI.

Значения насыщения гемоглобина кислородом из MSI и EPOS легко сравнивать, поскольку оба они измеряются в %.Измерения за временной интервал 9 минут (от 1 минуты до окклюзии до 3 минут после освобождения) сравнивали с использованием линейного регрессионного анализа. Временной интервал был выбран для выравнивания распределения значений насыщенности между высокими и низкими значениями. Значения насыщения обычно стабильны в течение исходного уровня и возвращаются к исходным значениям через несколько минут после освобождения, что приводит к чрезмерному представлению значений в этом диапазоне, если необходимо включить все измерения.

Метод Бланда-Альтмана ²⁴ использовался для сравнения методов измерения MSI и EPOS.Анализ проводился для трех временных интервалов: исходный уровень, конец окклюзии и вскоре после освобождения. ²⁵ Чтобы избежать измерений во время надувания окклюзионной манжеты, для базового анализа использовались значения за 55 с исходных измерений (от 60 с до 5 с до начала окклюзии). Интервал окончания окклюзии (от 60 с до 10 с до выпуска) был выбран соответствующим образом. После освобождения отчетливо выражена реперфузия. Чтобы зафиксировать максимальное насыщение в анализе Бланда-Альтмана, мы решили использовать медиану девяти выборок вокруг максимального значения в интервале от 5 с до релиза до 55 с после релиза. Среднее значение рассчитывали для каждого временного интервала для измерений MSI и EPOS соответственно. Среднее отклонение было рассчитано вместе с верхним и нижним пределами, установленными на среднее значение ± 1,96 стандартного отклонения.

Невозможно сравнить значения фракции ткани эритроцитов между MSI (относительные единицы) и EPOS (% фракции ткани) без масштабирования данных MSI. Таким образом, среднее значение тканевой фракции эритроцитов ⟨fRBC⟩, оцененное по данным, усредненным в интервале от 1 минуты до окклюзии до 3 минут после освобождения, включая всех субъектов, было рассчитано для данных MSI и EPOS отдельно.Затем данные MSI были откалиброваны путем умножения на ⟨fRBC,  EPOS⟩/⟨fRBC,MSI⟩. Для сравнения результатов был использован линейный регрессионный анализ. Анализ Бленда-Альтмана также был выполнен, как описано выше, для данных, полученных на исходном уровне и во время окклюзии. Значения тканевой фракции эритроцитов, полученные во время фазы реперфузии, не отличаются от уровней, обнаруженных во время исходного уровня и окклюзии, и поэтому не учитываются.

Чтобы найти возможные различия в чувствительности к фракции ткани эритроцитов между двумя методами, были рассчитаны отношения значений фракции ткани эритроцитов в конце окклюзии и во время исходного уровня как для артериальной, так и для венозной окклюзии.Стандартное отклонение отношения было выше для MSI, чем для EPOS, особенно во время артериальной окклюзии (таблица 2). Таким образом, отношение MSI сравнивалось с отношением EPOS с использованием непараметрического критерия знакового ранга Уилкоксона.

2.10.

Глубина проникновения для MSI и EPOS

Для проверки глубины отбора проб для систем MSI и EPOS был проведен ряд симуляций методом Монте-Карло. Значения имитации ткани для µs′(λ) и µa(λ) использовались при длинах волн 475 и 630 нм.Оптические свойства ткани, составленные на основе популяционного исследования in vivo ²³ [значения µa(λ) являются предварительными и еще не опубликованы], составляли 3,20 и 1,80 (мм–1) для µs′(λ) и 0,20. и 0,01 (мм–1) для µa(λ) соответственно.

2.11.

Исключение данных

Данные трех субъектов были исключены из-за плохого сигнала EPOS (один субъект) и критериев исключения (один субъект пил кофе перед измерениями, а у одного было кожное заболевание). Еще один субъект был исключен из протокола венозной окклюзии из-за несоблюдения протокола исследования.Остальные данные, используемые для статистического анализа, были собраны у 21 субъекта во время артериальной окклюзии и 20 субъектов во время венозной окклюзии.

3.

Результаты

В таблице 1 представлены средние значения насыщения гемоглобина кислородом и фракции ткани эритроцитов, оцененные с помощью систем MSI и EPOS во время артериальной и венозной окклюзии у всех субъектов в течение трех временных интервалов, обозначенных серыми горизонтальными линиями на рис. 2( а). Субъект, используемый в качестве примера на рис. 2, 4 и 5 был выбран на основании коэффициента корреляции R2 между оценочными значениями насыщения гемоглобина кислородом MSI и EPOS, наиболее близкими к среднему значению для всех испытуемых.

Таблица 1

Насыщение гемоглобина кислородом (SO2) и тканевая фракция эритроцитов (fRBC), оцененные с помощью MSI и EPOS на исходном уровне, в конце окклюзии и в начале реперфузии (среднее (SD) и [min max] для всех включенных субъектов) . Для fRBC во второй строке представлены значения MSI, откалиброванные по данным EPOS.

		Исходный уровень	Конец окклюзии	Реперфузия
SO2  во время артериальной окклюзии	MSI (%) 16 (9.9)	1.5 (2.4)	82.4 (7.4)
		[21,7 62,7]	[0 9.5]	[55,6 93,8]
	EPO (%)	55,8 (10. 3)	1.8 (1.7)	88.2 (5.7)
		[39.5 71.7]	[-0,6 5.5]	[69.2 96.21	[69.2 96.2]
FRBC во время венозной окклюзии	MSI (-)	0,012 (0,0042)	0,044 (0,0093)	0,025 (0,0064)
		[0.0050 0.021]	[0,025 0,062]	[0,013 0,034]
	откалиброванные MSI (%)	0,28 (0,095)	0,28 (0,095)	1,00 (0.21)	0,56 (0,15)
		[0,12 0,48]	[0. 58 1.42]	[0.29 0.77]
	EPO (%)	0,46 (0,12)	0,86 (0,18)	0,86 (0,18)	0,57 (0,13)
		[0,18 0,71]	[0.50] 1,21]	[0,32 0,80]

Рис.2

(a) Насыщение гемоглобина кислородом (SO2) во время типичной артериальной окклюзии (MSI = жирная линия, EPOS = тонкая линия). Окклюзия начинается при t=300  с и заканчивается при t=600  с. Вертикальные линии указывают временной интервал, используемый для регрессионного анализа (от 240 до 780 с). Временные интервалы, используемые для анализа Бланда-Альтмана, отмечены серым цветом для исходного уровня (от 240 до 295 с), окклюзии (от 540 до 590 с) и реперфузии (от 595 до 655 с). (б) Линейный регрессионный анализ данных в (а) (каждая 10-я точка данных). Представлены данные во время исходного уровня (квадраты), окклюзии (кружки), реперфузии (треугольники) и аппроксимированной регрессии (сплошная линия).

Изменения насыщения кислородом для выбранного субъекта во время провокации артериальной окклюзии представлены на рис. 2(а). Средний уровень насыщения кислородом на исходном уровне, оцененный по системе MSI, составляет 41,5% в первый указанный временной интервал (серые горизонтальные линии). Когда начинается окклюзия, она уменьшается, и через 5 минут окклюзии уровни насыщения кислородом снижаются всего до 2%. При снятии окклюзии насыщение кислородом достигает пика 84,7% в период гиперемии. Насыщение кислородом затем снижается до исходного уровня.

Насыщение кислородом, рассчитанное системой MSI, сравнивали с данными EPOS с помощью линейного регрессионного анализа. На рис. 2(b) представлены выборочные данные с рис. 2(a) и построенная линейная регрессия. Для этого субъекта R2 составляет 0,964, а наклон линии равен 1,05. Для всей популяции из 21 включенного субъекта среднее значение R2 составляет 0,958 со значениями в диапазоне от 0,904 до 0,993.

Анализ Бланда-Альтмана был проведен для 21 субъекта в три выбранных интервала времени, указанных на рис.2(а). Результат представлен на рис. 3. Методы MSI и EPOS дают аналогичные результаты для низкого насыщения кислородом в конце окклюзии. Среднее отклонение составляет 0,3% с верхним и нижним пределами отклонения 3,6% и -4,2% соответственно. Базовые измерения показывают большую разницу со средним отклонением 13,2% с верхним и нижним пределами 4,3% и отклонением -30,7%. Значения EPOS обычно значительно выше, чем значения MSI. Более высокие значения EPOS также обнаруживаются во время реперфузии, но не в такой степени.Среднее отклонение составляет 5,6% с верхним и нижним пределами 4,4% и отклонением -15,9% соответственно.

Рис. 3

Согласованность насыщения гемоглобина кислородом (SO2) между значениями, оцененными MSI и EPOS из анализа Бланда-Альтмана у 21 субъекта в трех отдельных временных интервалах [см. рис. 2(a)] во время артериальной окклюзии: исходный уровень ( квадраты/пунктир), окончание окклюзии (кружки/сплошные линии) и реперфузии (треугольники/штрихпунктирные линии). Средняя разница для каждой фазы представлена ​​тонкими линиями, а разница ±1.96 * стандартное отклонение (интервал предсказания 95%) жирными линиями.

На рис. 4 показаны изображения насыщения кислородом с пространственным разрешением, рассчитанные в трех разных временных точках для того же субъекта, что и на рис. 2. На исходном уровне и при окклюзии была выбрана последняя временная точка в интервалах, указанных на рис. 2(а), тогда как момент времени с пиковым насыщением кислородом был выбран в пределах реперфузионного интервала. Три куба данных интенсивности, полученные системой MSI, были проанализированы попиксельно, отображая насыщение кислородом предплечья.

Рис. 4

Насыщение кислородом с пространственным разрешением, оцененное MSI. Для исходного уровня (а) и окклюзии (б) были выбраны последние временные точки интервалов, указанных на рис. 2(а), тогда как для реперфузии (в) была выбрана временная точка с максимальным насыщением кислородом в интервале. Область интереса, используемая для усреднения данных, представленных на рис.  2, обведена белым квадратом.

Данные о фракции ткани эритроцитов, оцененные во время венозной окклюзии для того же субъекта, что и на рис. 2, представлены на рис.5(а). Уровни стабильны в исходном состоянии, но быстро увеличиваются при окклюзии руки. Во время окклюзии увеличение продолжается, но более медленными темпами. Сразу после снятия окклюзии уровни падают и вскоре снова достигают исходного уровня. Расчетные значения фракции ткани эритроцитов по EPOS составляют 0,38% в начале исследования и 0,79% в конце окклюзии. Данные MSI калибруются, как описано в разд. 2.9 до сравнения с данными EPOS.

Рис. 5

(a) Фракция ткани эритроцитов (fRBC) во время типичной венозной окклюзии (калибровка MSI = жирная линия, EPOS = тонкая линия).Для калибровки данных MSI см. разд. 2.9. Окклюзия начинается при t=300  с и заканчивается при t=600  с. Вертикальные линии указывают временной интервал, используемый для регрессионного анализа (от 240 до 780 с). Временные интервалы, используемые для анализа Бланда-Альтмана, отмечены серым цветом для базовой линии (от 240 до 295 с) и окклюзии (от 540 до 590 с). (б) Линейный регрессионный анализ данных в (а) (каждая 10-я точка данных). Представлены данные во время исходного уровня (квадраты), окклюзии (кружки), реперфузии (треугольники) и аппроксимированной регрессии (сплошная линия).

Был проведен линейный регрессионный анализ значений тканевой фракции эритроцитов при венозной окклюзии для всех 20 включенных субъектов.На рис. 5(b) представлен регрессионный анализ данных на рис. 5(a). Для этого субъекта R2 составляет 0,982, а наклон линии равен 0,61. Для всех включенных субъектов среднее значение R2 составляет 0,925 со значениями в диапазоне от 0,717 до 0,984. R2>0,9 у 75% испытуемых.

Результаты анализа Бланда-Альтмана для 20 субъектов представлены на рис. 6 для двух временных интервалов, указанных на рис. 5(а). После нормализации доля ткани эритроцитов недооценивается измерениями MSI на исходном уровне со средним отклонением -0.18, а верхний и нижний пределы 0,014 и -0,37 соответственно по сравнению с EPOS. В конце венозной окклюзии фракция ткани эритроцитов занижается MSI по сравнению с EPOS со средней погрешностью 0,14 и верхним и нижним пределами 0,49 и -0,21 соответственно.

Рис. 6

Согласованность фракции ткани эритроцитов (fRBC) между значениями, оцененными с помощью MSI (откалибровано) и EPOS из анализа Бланда-Альтмана у 20 субъектов в два разных временных интервала [см. рис. 5 (a)] во время венозной окклюзии : исходная линия (квадраты/пунктирные линии) и в конце окклюзии (кружки/сплошные линии).Средняя разница для каждой фазы представлена ​​тонкими линиями, а разница ±1,96 * стандартное отклонение (интервал прогноза 95%) — жирными линиями.

Соотношения расчетной фракции ткани эритроцитов между концом окклюзии и исходным уровнем по MSI и EPOS представлены в таблице 2 как для артериальной, так и для венозной окклюзии. Отношение было значительно выше при измерении с помощью MSI (p<0,001, артериальная и венозная окклюзия) и наиболее заметно при венозной окклюзии, когда изменение фракции ткани эритроцитов является очевидным.

Расчетная средняя максимальная глубина проникновения фотонов на двух длинах волн 475 и 630 нм составляет 0,43 и 0,79 мм с EPOS (каждое значение является средним результатом для волокна детектора источника DRS на расстояниях 0,40 и 1,20 мм) соответственно. Аналогичные значения MSI составляют 0,45 и 1,79 мм соответственно.

Таблица 2

Отношение предполагаемой фракции ткани эритроцитов между конечной окклюзией и исходным уровнем для MSI и EPOS во время артериальной и венозной окклюзии (среднее значение и (SD) для всех включенных субъектов).

4.

Обсуждение

В этом исследовании мы разработали и оценили алгоритм оценки насыщения микрососудистого гемоглобина кислородом и доли ткани эритроцитов на основе собранных данных MSI моментального снимка. Алгоритм, основанный на обратном моделировании Монте-Карло, использует шесть параметров для моделирования переноса света в ткани, при этом трем параметрам присваиваются фиксированные значения, а трем параметрам присваиваются определенные значения, относящиеся к ткани кожи. Измерения во время окклюзии вен и артерий предплечья у 24 человек показывают, что оценка насыщения гемоглобина кислородом и фракции ткани эритроцитов с помощью нашей системы и алгоритма MSI сильно коррелирует с этими измерениями с использованием эталонной системы на основе датчиков. Однако существуют систематические различия, которые можно объяснить различиями в объеме выборки.

При синхронизации по времени между MSI и EPOS реакции на окклюзию и реперфузию кажутся одновременными в обоих методах.Окклюзия плечевых сосудов влияет на всю руку в дистальном направлении, и поэтому два места измерения (MSI и EPOS) подвергаются одинаковому влиянию. Пространственные различия в тканевых соединениях между участками, например наличие мелких или крупных сосудов или других структур, могут влиять на результат на индивидуальном уровне, но усредняются в популяции.

Значения насыщения гемоглобина кислородом оцениваются и подтверждаются с помощью линейного регрессионного анализа, показывающего средний коэффициент корреляции R2=0. 956 по сравнению с эталонной системой EPOS. Применение анализа Бланда-Альтмана MSI и EPOS показывает, что согласие лучше всего в конце окклюзии, когда оксигенация низкая. Существует смещение между измерениями MSI и EPOS во время исходного уровня, где MSI показывает более низкое насыщение гемоглобина кислородом.

Поскольку значения фракции ткани эритроцитов MSI являются относительными в отличие от значений, измеренных EPOS, значения MSI калибруются по данным EPOS перед сравнением. Применение линейного регрессионного анализа показывает, что R2=0.927, в то время как анализ Бланда-Альтмана показывает, что MSI недооценивает на исходном уровне и аналогичным образом завышает значения конца окклюзии по сравнению с результатами EPOS RBC.

Дополнительное моделирование методом Монте-Карло глубины проникновения показывает, что для более длинных длин волн, когда поглощение света гемоглобином низкое, система MSI имеет объем выборки, проникающий значительно глубже в ткань (1,79 мм) по сравнению с EPOS (0,79 мм). Наиболее поверхностные вены находятся на глубине около 0.75 мм в ткани предплечья, ²⁶ , что говорит о том, что они в основном не обнаруживаются системой EPOS. Систематические различия между значениями MSI и EPOS могут быть объяснены этой разницей в объемах выборки, что фактически делает измерения MSI более подверженными влиянию венозной крови.

В конце артериальной окклюзии как MSI, так и EPOS берут образец сосудистого русла с существенно деоксигенированным гемоглобином. Аналогичным образом, оба метода берут пробы сосудистого русла с существенно насыщенной кислородом кровью вскоре после устранения окклюзии из-за короткого времени капиллярного транзита и низкой экстракции кислорода во время гиперемии, вызванной высокой скоростью кровотока.Однако на исходном уровне разница в оксигенации между сосудистыми сплетениями более выражена, из-за чего разные объемы выборки двух модальностей сильнее влияют на показатели кислорода.

Различия в объеме пробы также могут объяснить большее изменение фракции ткани эритроцитов, измеренное MSI, чем EPOS, при сравнении исходных данных и данных в конце окклюзии в таблице  2. Это наблюдение справедливо как для артериальной, так и для венозной окклюзии, но более выражено для последней. Глубоко залегающие венозные сосуды обладают высокой емкостью и фракция ткани эритроцитов в этих сосудах увеличивается при накоплении крови при окклюзии.MSI с его более глубоким объемом отбора проб будет отбирать больше венозной крови, чем EPOS, что объясняет разницу в оценке объема крови.

Во время венозной окклюзии доля ткани эритроцитов постепенно увеличивается на протяжении всего периода окклюзии, как и ожидалось. При анализе уровней фракции ткани эритроцитов во время артериальной окклюзии (данные не представлены) доля ткани эритроцитов аналогичным образом увеличивается во время надувания манжеты, но также изменяется после того, как давление в манжете достигает уровней, значительно превышающих артериальное давление.Это можно объяснить перераспределением крови, вызванным начальной разницей давления между артериями и венами, в результате чего кровь течет из глубоких артерий, расположенных значительно ниже глубины взятия проб, в вены, расположенные глубоко, но видимые для наших измерительных систем.

Описанный алгоритм можно применить к отдельным пикселям куба данных MSI для получения результатов с пространственным разрешением, как показано на рис. 4. В этом исследовании данные MSI с площади размером 2 × 2   см были усреднены, проанализированы, и сравнивали с данными точечного измерительного зонда EPOS.Пример на рис. 4 показывает небольшие пространственные вариации насыщения кислородом в пределах области интереса, что указывает на то, что усреднение оказывает ограниченное влияние на результат. Пространственно усредненные данные MSI по сравнению с данными EPOS могут демонстрировать меньшее соответствие из-за разных мест отбора проб. Однако для всего исследования значения MSI и EPOS хорошо совпадали, особенно для насыщения гемоглобина кислородом, где значение R2 > 0,90 для всех субъектов.

Другие группы использовали камеру MSI для моментальных снимков от XIMEA для измерения насыщения тканей кожи кислородом.Бауэр и соавт. ¹² описывают метод спектральной коррекции характеристик камеры XIMEA, при котором снижается нежелательная спектральная пиковая чувствительность. Это важно при использовании обратных алгоритмов, которые не полностью учитывают полную спектральную чувствительность каждого пикселя, а вместо этого анализируют данные на основе значений рассеяния и поглощения для одной длины волны (т. е. пиковой длины волны). Наш подход не страдает от этого ограничения, поскольку учитывается полное спектральное поведение как ткани кожи, так и характеристики детектора.Однако это делается за счет требовательного к вычислительным ресурсам алгоритма, основанного на моделировании методом Монте-Карло, что делает его непригодным для анализа полных изображений в реальном времени. Бауэр и соавт. применили свой алгоритм для оценки относительных изменений насыщения крови кислородом на тыльной стороне ладони, используя только 3 из 16 доступных каналов. Относительно низкая скорость сбора данных (1 кадр/с) позволяла рассчитывать значения в режиме реального времени. Для динамической оценки системы использовали артериальную окклюзию плеча.Результаты сравниваются со стандартизированной системой на основе зонда, которая измеряет в ближнем инфракрасном (БИК) режиме ²⁷ , и объем выборки для двух систем значительно различается. ¹² Bauer et al. обнаружили различия в оксигенации при окклюзии, как и мы, но сравнить расчетные значения насыщения кислородом невозможно, так как все представленные значения нормированы на диапазон [0 1] и сравниваются только формы кривых.

Рубинс и др. использовали алгоритм сегментации k-средних и двухслойную оптическую диффузную модель, чтобы связать интенсивности, измеренные камерой XIMEA со стороны ладони, с уровнями насыщения кожи кислородом.Их протокол включал окклюзию плеча до 150 мм рт. ст. в течение 10 минут. ¹³ Результаты нельзя сравнивать с нашими значениями, поскольку значения не являются количественными и не сравниваются с эталонным методом. Давление в манжете было значительно ниже, чем давление, используемое в нашем протоколе, и, возможно, не давало подобного ответа. Кроме того, динамический ответ в фазе реперфузии был ограничен тем же уровнем, что и значения насыщения кислородом, оцененные на исходном уровне (100%). ¹³

На чувствительность к спектрам поглощения гемоглобина влияют основные длины волн, и алгоритм анализа можно улучшить за счет грамотного выбора или комбинации каналов. ^{22 , 28} Однако эти датчики уникальны, и спектральные свойства, такие как длина волны пика, различаются между образцами. Следовательно, при разработке алгоритмов, которые должны работать не только для одной камеры, фиксированные предварительно выбранные длины волн или каналы не являются приемлемым вариантом. В этой работе мы представляем дополнительную стратегию, которая решает эту проблему. В целом, наш подход работает хорошо. Однако в нашем алгоритме нелинейной оптимизации присутствуют некоторые невязки при подгонке смоделированных данных к измеренным данным, что может объяснить некоторые различия, обнаруженные между двумя сравниваемыми модальностями.Происхождение этих остатков, скорее всего, можно найти в спектральной чувствительности, предоставленной производителем. Предварительные данные показывают, что эти спектральные чувствительности могут быть неточными при добавлении к датчику оптической линзы, что требует дальнейших калибровочных измерений.

5.

Заключение

Мы продемонстрировали, что обратный алгоритм Монте-Карло, основанный на двухслойной модели кожи с тремя свободными параметрами, может точно и последовательно моделировать спектры, полученные с помощью камеры моментальных снимков MSI со сложными характеристиками фильтра.Данные, полученные с кожи предплечья во время артериальной и венозной окклюзии, показывают, что насыщение гемоглобина кислородом и фракция ткани эритроцитов, оцененные по данным MSI, имеют высокую корреляцию со значениями, совместно зарегистрированными с помощью проверенной системы EPOS на основе зондов. Были обнаружены некоторые систематические различия, но они могут быть объяснены большим объемом выборки для системы MSI на более длинных волнах, где поглощение ткани низкое.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотят поблагодарить Юстуса Хеллмана за его помощь во время проведения измерений. Мы также хотим поблагодарить Ингемара Фредрикссона за ценную помощь и советы относительно измерений системы EPOS и интерпретации данных. Это исследование было поддержано шведским агентством инноваций VINNOVA в рамках программ Swelife и MedTech5Health (гранты № 2017-01435 и 2019-01522), а также исследовательской организацией CENIIT в Университете Линчепинга (проект ID 11.02).

Ссылки

2. 

15. 

17. 

20. 

25. 

27. 

Биография

Мария Эверлёф является аспиранткой, интересующейся биомедицинской оптикой, на кафедре биомедицинской инженерии Линчёпингского университета, Швеция. Ее исследования в области биомедицинской оптики (https://liu.se/en/employee/marew49) включают мультиспектральную визуализацию моментальных снимков для пространственной и временной оценки микроциркуляторных свойств ткани кожи человека.

Э. Йоран Салеруд — заместитель заведующего кафедрой биомедицинской инженерии Университета Линчепинга. Его исследования относятся к области биомедицинской оптики (https://liu.se/en/employee/gorsa75) и сосредоточены на гиперспектральной визуализации и микроскопии, исследуя пространственную и временную физиологию микроциркуляции. В трансляционной работе биомедицинской оптики участвуют здоровые субъекты с редкими заболеваниями и точки оказания помощи новым методам и технологиям.

Томас Стрёмберг — заведующий кафедрой биомедицинской инженерии Линчепингского университета.Его исследования относятся к биомедицинской оптике (https://liu.se/en/employee/tomst50) с упором на моделирование переноса света в точечной и визуализирующей лазерной доплеровской флоуметрии, лазерной спекл-спектроскопии и спектроскопии диффузного отражения. Работа проводится в тесном сотрудничестве с клиническими исследователями и промышленностью.

Маркус Ларссон — старший преподаватель кафедры биомедицинской инженерии Линчёпингского университета, Швеция. Его исследования сосредоточены на теоретической и прикладной биомедицинской оптике (https://liu.se/en/employee/marla29) для характеристики тканей и микроциркуляторного русла с использованием методов на основе спеклов и стационарных спектроскопических методов. Это включает совместную работу с промышленностью и клиническими исследователями.

Снижение насыщения кислородом внутренней мозговой вены у пациентов с серповидно-клеточной анемией, выявленное с помощью Qsm-MRI | Кровь

Введение:

Визуализация оксигенации головного мозга может быть мощным инструментом для оценки риска инсульта у пациентов с серповидно-клеточной анемией (SCD) и потенциально может помочь в профилактике инсульта.В настоящее время существуют разногласия в оценке доли извлечения кислорода методами, измеряющими оксигенацию тканей из глубоких структур головного мозга, и методами, измеряющими оксигенацию крови в сагиттальном синусе. Количественное картирование восприимчивости (QSM) — это метод МРТ, который может неинвазивно измерять насыщение венозной крови кислородом (S _v O ₂ ) в глубоких мозговых структурах на основе сдвига магнитной восприимчивости венозной крови, вызванного дезоксигемоглобином. В этом исследовании наша цель состояла в том, чтобы сравнить венозную сатурацию кислорода, измеренную с помощью QSM во внутренней церебральной вене (ICV), с венозной оксигенацией в сагиттальном синусе (SS) у пациентов с ВСС, анемией с нормальным гемоглобином и здоровым контролем.

Методы:

В исследовании приняли участие 16 пациентов с ВСС, 7 пациентов с несерповидной анемией и 11 здоровых лиц (таблица 1). Все субъекты предоставили письменное согласие на протокол, одобренный Комитетом по клиническим исследованиям (CCI № 11-00083).

Изображения были получены с помощью клинической системы Philips 3 Тл с 32-канальной радиочастотной катушкой. Последовательность трехмерных градиентных эхо-сигналов имела параметры: TR = 30 мс, α = 25°, 2 эха: TE1 = 4,94 мс, ΔTE = 5,2 мс, FOV = 210 x 190 x 120 мм, пространственное разрешение: 0.6 x 0,6 x 1,3 мм, коэффициент ускорения SENSE = 2 в направлении фазового кодирования, BW = 289 Гц/пиксель и общее время сбора данных = 6 минут 50 секунд. Компенсация потока добавлялась только в направлении считывания, которое было передне-задним (AP) направлением.

Для каждого субъекта были подобраны фазовые изображения для создания карты поля B0. Извлечение мозга и развертку фазы выполняли с использованием FSL. Фоновое поле было удалено с помощью PDF. Недостоверные фазовые воксели были идентифицированы и удалены из маски мозга для последующей обработки.L1-регуляризованная инверсия поля к восприимчивости была выполнена для получения карты восприимчивости (лямбда = 4*10 ^-4 ). Насыщение венозной крови кислородом рассчитывали на основе:

χ = (1 — S _v O ₂ )χ _do Hct + χ _ow Hct [1]

, где χ — измерение восприимчивости χ _до — сдвиг чувствительности на единицу гематокрита между полностью оксигенированными и полностью деоксигенированными эритроцитами, а χ _ow — сдвиг чувствительности между оксигенированными клетками крови и водой.Для χ _d-o и χ _o-w использовались значения 0,27 ppm (единица СГС) и -0,03 ppm.

Маска области исследования ICV была выбрана вручную на основе карты восприимчивости с пороговым значением 0,1 ppm, чтобы избежать эффекта частичного объема. Был включен только сегмент, который имел угол менее 30 градусов по отношению к оси AP. Цель состояла в том, чтобы исключить области, которые были восприимчивы к артефакту потока. Рассчитывали среднее венозное насыщение кислородом внутри ROI. Групповые различия венозной сатурации кислорода оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты:

На рис. 2а показано линейное увеличение магнитной восприимчивости ICV с гематокритом, как это предсказывает уравнение [1]. Среднее ICV венозное насыщение кислородом в трех группах составило 73,9% в CTL, 73,6% в ACTL, по сравнению с SCD 69,3%, p<0,05 при дисперсионном анализе. На рис. 3 сравнивается насыщение кислородом ICV и SS в зависимости от концентрации гемоглобина. При нормальных значениях гемоглобина сатурация СС была ниже, чем при ИЦВ, но эта разница исчезала с увеличением тяжести анемии.После контроля уровня гемоглобина не было различий между группами пациентов в насыщении кислородом в любом месте.

Обсуждение:

У пациентов без анемии сатурация кислорода при СС была ниже, чем при ИВЛ, что потенциально отражает повышенную потребность коры головного мозга в кислороде по сравнению с глубокими структурами мозга. ICV является одной из основных глубоких кортикальных вен, и насыщение кислородом этой вены может указывать на оксигенацию глубоких структур полушарий головного мозга, включая базальные ганглии, мозолистое тело и таламус.При прогрессирующей анемии мозговой кровоток увеличивается для сохранения доставки кислорода в мозг (не показано), но способствует перфузии серого вещества за счет глубоких структур белого вещества. Это может объяснить снижение венозной сатурации гемоглобином, наблюдаемое при ИЦВ, по сравнению с повышением венозной сатурации, наблюдаемым при СС. В качестве альтернативы, глобальное увеличение кровотока может привести к гомогенизации и сокращению времени микроваскулярного транзита, выравнивая экстракцию кислорода по сосудистым территориям головного мозга.

Раскрытие информации

Coates: celgene: Консультации, гонорары, прочее: руководящий комитет клинического исследования; agios pharma: Консультации, гонорары; vifor: Консультации, Гонорары; apo pharma: Консультации, Гонорары, Бюро выступлений. Древесина: Апофарма: Консультации; Биомедицинская информатика: Консультации; Национальные институты здравоохранения: Финансирование исследований; Imago Biosciences: Консультации; WorldcareClinical: Консультации; Philips Healthcare: Финансирование исследований; BluebirdBio: Консультации; Celgene: Консультации.

Пульсоксиметрия | Американская ассоциация легких

Если у вас есть симптом одышки или известное заболевание легких или сердца, ваш врач может порекомендовать вам использовать пульсоксиметр.Пульсоксиметр, или Pulse Ox,   , представляет собой электронное устройство, измеряющее насыщение кислородом эритроцитов. Пульсоксиметры можно прикрепить к пальцам, лбу, носу, стопе, ушам или пальцам ног. После этого устройство может быть использовано повторно или утилизировано. Если вы используете это в домашних условиях, вы должны спросить своего поставщика медицинских услуг, прежде чем утилизировать устройство пульсоксиметра, так как оно может быть дорогим и многоразовым.

В феврале 2021 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов опубликовало предупреждение об ограничениях пульсоксиметров.Если у вас плохое кровообращение, темная пигментация кожи, толстая кожа, вы курите в настоящее время, температура вашей кожи прохладная, вы пользуетесь темным лаком для ногтей, длинными искусственными ногтями или если ваши пальцы грязные, пульсоксиметр может показывать неточные или противоречивые показания. Вот почему цифры пульсоксиметра не следует использовать изолированно для определения состояния вашего здоровья. Важно поделиться показаниями, которые являются ненормальными или несовместимыми с вашим лечащим врачом.

Читайте о COVID-19 и пульсоксиметрии в нашем блоге «Каждое дыхание»: Пульсоксиметрия — небольшое знание может быть опасным.

Чего ожидать?

При аккуратной работе вы можете рассчитывать на простое, быстрое и безопасное измерение уровня насыщения организма кислородом. Датчик будет установлен, и в течение нескольких секунд пульсоксиметр покажет частоту сердечных сокращений и уровень насыщения крови кислородом, как показано на рисунке выше. При оксиметрическом измерении не используются иглы и не возникает боли.В некоторых больницах также используются одноразовые ленточные зонды, которые наматываются на палец, нос или ногу.

Пульсоксиметр использует источник холодного света, который пропускает свет через кончик пальца, делая его красным. Анализируя свет от источника света, который проходит через палец, устройство может определить процентное содержание кислорода в эритроците.

Понимание результатов

Пульсоксиметр наблюдает за быстрым измерением уровня насыщения организма кислородом без использования игл или забора крови.Измеренное количество, отображаемое на экране, отражает насыщение ваших эритроцитов кислородом. Этот номер дает вашим врачам и медсестрам представление о том, каким будет ваше лечение. Уровень кислорода также может помочь определить, нужно ли вам получать дополнительный кислород. Это число сатурации (хорошее число должно быть более 90-92%) отличается от значения, называемого pO2 (хорошее число должно быть более 60-65), которое измеряется при заборе крови из артерии. Ваш врач может уточнить значение вашей ценности в вашей конкретной ситуации.

Каковы риски?

Нет никаких известных рисков или опасностей использования пульсового оксиметра, когда значения анализируются и контролируются компетентным медицинским работником.

Tissue Oxygen Saturation – обзор микроциркуляции

Локальное среднее насыщение гемоглобина кислородом во всех красных кровяных тельцах (эритроцитах) называется насыщением тканей кислородом или насыщением кислородом эритроцитов. Это важный параметр для измерения, чтобы оценить как доставку кислорода, так и его поглощение тканями.Он отличается от общеизвестной пульсоксиметрии тем, что выявляет насыщение кислородом всей крови, включая микроциркуляцию, как артериальную, так и венозную. В пульсоксиметрии выходной сигнал связан с насыщением кислородом пульсирующих артерий.

Комбинируя измерения насыщения тканей кислородом и скорости перфузии, можно получить всестороннее представление о микроциркуляции и тканевом метаболизме. Мы предлагаем прибор PeriFlux 6000 EPOS для измерения этих микроваскулярных параметров в том же объеме пробы с использованием встроенного оптоволоконного датчика и усовершенствованного анализа сигналов на основе моделей.Параметры из EPOS:

• Насыщение эритроцитов кислородом (%)
• Фракция ткани эритроцитов: грамм эритроцитов на 100 грамм ткани (%)
• Оксигенированная и восстановленная концентрация гемоглобина в ткани (мкМ)
• Перфузия с разрешением по скорости: грамм эритроцитов / 100 грамм ткани × мм/сек (% эритроцитов × мм/сек). Три различных диапазона скорости: 10 мм/сек
• Глубина измерения (мм)

Различные протоколы провокаций, такие как локальное нагревание или окклюзия плеча, предпочтительно используются в сочетании с этими микроциркуляторными измерениями, чтобы получить больше информации о функции микроциркуляторного русла.В приборе EPOS встроена автоматическая поддержка таких провокаций.

Подпись к рисунку: Измерение постокклюзионной реактивной гиперемии на предплечье, пятиминутная окклюзия плеча между 2 и 7 минутами.

Каталожные номера:

1. Обратный метод Монте-Карло в модели многослойной ткани: объединение спектроскопии диффузного отражения и лазерной доплеровской флоуметрии. Фредрикссон И., Бурдаков О., Ларссон М., Стрёмберг Т.Журнал биомедицинской оптики. 18(12), 2013.
2. Насыщение кислородом, фракция ткани эритроцитов и скорость перфузии с разрешением — новый оптический метод оценки микроциркуляции. Йонассон Х., Фредрикссон И., Петтерссон А., Ларссон М., Стрёмберг Т. Исследования микрососудов. 102, 2015.
3. Дисфункция эндотелия микрососудов кожи связана с диабетом 2 типа независимо от микроальбуминурии и жесткости артерий. Йонассон Х., Бергстранд С. и соавт. Исследование диабета и сосудистых заболеваний.14(4), 2017.
4. Взаимосвязь между перфузией кожи предплечья с разрешением по скорости и насыщением кислородом, а также амплитудами пульсации артерий пальцев как косвенные показатели эндотелиальной функции. Бергстранд С., Моралес М.А., Коппини Г., Ларссон М., Стрёмберг Т. Микроциркуляция. 25(2), 2018.
5. Валидация лазерной допплеровской перфузии с разрешением по скорости в мультимодальной оптической системе с использованием фантома кровотока. Йонассон Х., Фредрикссон И., Ларссон М., Стрёмберг Т., Журнал биомедицинской оптики 24(9), 2019.
6. Нормативные данные и влияние возраста и пола на функцию микроциркуляции в когорте среднего возраста: результаты исследования SCAPIS.
   Как насытить клетки кислородом: Как можно в домашних условиях обеспечить организм кислородом

   Добавить комментарий Отменить ответ

   Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

   Комментарий *

   Имя *

   Email *

   Сайт