Что лучше регулон или медиана: «Регулон» или «Мидиана»? – meds.is

(A) Значимые термины онтологии генов (GO; биологические процессы) для каждого модуля. Все регуляторы и прямые цели в модулях используются для анализа GO и перечислены под модулем (ось x). Соотношение генов показывает процент от общего числа генов GO-термина, идентифицированных как обогащенные в модуле.Список генов, учитывающий только регулоны (без прямых мишеней), был слишком скудным, чтобы производить значимые термины GO на каждый модуль. (B) Анализ пути реактома с использованием регулонов в модулях. Только регулоны внутри модулей используются для анализа пути и перечислены под модулем (ось x). Только значимые (qval <0,05) и обогащенные края учитывались для количественной оценки и выделялись как размеры отметок.

(A, B, C) Матрица индекса соединения (CSI) для атласа каждой ячейки.Идентифицированные регулоны окрашены, как на рис. 2B (пять модулей), что указывает на совместную регуляцию и различные роли в разных типах клеток и тканях. Регулоны, указанные в отдельных атласах, но не во встроенном атласе, отмечены серым цветом. (D, E, F) Сеть Regulon для атласа каждой соты. Каждый регулятор представлен в виде узла, узлы подключаются, если оценка CSI> 0,7, и окрашены, как на рис. 2C (пять модулей). В атласе каждой клетки сохранены как общая, так и уникальная архитектура регулонов.Подобно интегрированной сети (рис. 2C), большие модули (3 и 4) соединены меньшими регулонами (1, 2 и 5) в атласе каждой ячейки. CSI для двух узлов (A, B) рассчитывается по формуле: Коэффициент корреляции Пирсона — это взаимосвязь между (A) и (B).

Чтобы исследовать перекрестные помехи регулонов внутри и между модулями интегрированного атласа, мы разработали неориентированную сеть регулонов с учетом наиболее взаимодействующих регулонов со строгой ассоциацией CSI (CSI> 0,7; рис. 2C).Как и ожидалось из корреляционной матрицы CSI (Рис. 2B), регулоны в модулях имеют более высокие связи, чем между модулями, что подразумевает согласованную регуляцию типов клеток в интегрированном атласе. Мы также оцениваем несколько сетевых характеристик, чтобы определить важность регуляторов для отдельных модулей, а также для регуляторной сети. Примечательно, что меньшие модули (1, 2 и 5) соединяют узлы между более крупными модулями (3 и 4) в сети. Внутри индивидуальных атласов мы обнаруживаем, что глобальная сеть регулонов в значительной степени сохраняется независимо от различий в составе регулонов внутри атласа (Fig S15D-F).Мы выделяем регулоны с важными регуляторными ролями в типах референсных клеток в отдельных атласах (рис. S16). Оценивая различные сетевые функции в интегрированной сети, мы обнаруживаем, что Cebpd (модуль 1), Gata3 (модуль 2) и Hdac2 (модуль 5) являются ключевыми узлами моста (промежуточная центральность), проходящими кратчайший путь через сеть. Верхние внутри- и межмодульные регулоны имеют сильно коррелированные сетевые характеристики (степень, близость и собственная центральность с составом регулонов; нижняя часть рис. 2С).Сетевые функции интегрированного атласа подробно описаны в Таблице S4.

(A, B, C) Индивидуальные активности регулона, выделенные в матрице типа регулон за клеткой для (A) TM-10x, (B) TM-SS2 и (C) мышиного клеточного атласа.

Для дальнейшей проверки модулей в интегрированной сети Regulon мы проводим несколько сравнений in silico. Во-первых, наша структура включает RCisTarget (как часть SCENIC) для определения регулонов, то есть TF и ​​прямых генов-мишеней.RCisTarget перекрестно сопоставляет идентифицированные регулоны с известными и аннотированными базами данных мишеней TF, сокращает косвенные ко-экспрессируемые мишени и позволяет оценивать взаимосвязи TF-TF и TF-цель. Следовательно, все прямые мишени данного регулона несут мотив регулона на соответствующих промоторах. Кроме того, мы ожидаем и наблюдаем, что многие регулоны в отдельных модулях имеют общие перекрывающиеся мотивы (корреляция мотивов на фиг. S17A). Мы также сообщаем о нескольких репрезентативных примерах регулонов и их мотивов в отдельных модулях (Рис. S17A).Затем мы оценили, опосредуются ли перекрестные помехи регулонов в интегрированной сети посредством белок-белковых взаимодействий (PPi). Сравнивая и накладывая аннотированный PPi из STRING (35), мы подтверждаем 57% сетевых соединений регулона (рис. S17B). Поскольку каждому PPi с аннотациями STRING присваивается комбинированный балл (мера достоверности), мы сравнили нашу сеть регулонов с комбинированным баллом STRING (в 20% -м интервале; рис. S17C). Соответственно, соединения регулярной сети имеют наивысший совокупный балл STRING.Кроме того, мы также наблюдаем сильную положительную взаимосвязь между комбинированной оценкой CSI регулона и STRING, подтверждая взаимодействие регулонной сети на основании экспериментальных данных (рис. S17D и таблица S5). Наконец, мы сравнили нашу сеть регулонов на наличие основных генов в базе данных Online Gene Essentiality (OGEE) (36). Мы наблюдаем 109 основных генов (70%) в нашей сети регулонов с сильным представлением во всех модулях (рис. S17E и таблица S5), что дополнительно подчеркивает важность регулонов во всей интегрированной сети.

(A) Вверху: корреляция мотивов между отдельными регулонами в каждом модуле. Строки и столбцы указывают отдельные последовательности мотивов разной длины. Внизу: репрезентативные примеры факторов транскрипции и их обогащенных мотивов для каждого модуля регулона. (B) Аннотированные межбелковые взаимодействия из STRING, наложенные на интегрированную сеть регулонов. STRING содержит все регулоны (узлы), и только STRING проверенные взаимодействия (черные края) выделены в сети регулонов.57% ребер сети регулонов проверяются STRING. (C) Распределение проверенных STRING взаимодействий, захваченных в сети регулонов, нанесено на 20 процентилей комбинированных интервалов оценки (ось x). Количество сетевых ссылок регулона указано над отдельными ячейками. Комбинированная оценка является мерой достоверности белок-белкового взаимодействия STRING. (D) Корреляция между специфическим индексом соединения регулона и показателем достоверности STRING. Планки погрешностей представляют собой доверительный интервал 95%.Красная линия указывает пороговое значение индекса для конкретного соединения, используемое для построения регулярной сети. (E) Сеть Regulon перекрыта экспериментально подтвержденными и важными генами (статус эссенциальности OGEE). Увеличенные узлы представляют собой важные гены, тогда как уменьшенные узлы отмечены как несущественные. Отсутствующие в OGEE регулоны показаны серым цветом.

Далее мы сосредоточились на регулонах с дифференциальным составом, которые управляют отдельными типами клеток (рис. 3A и S16). Реглон Cebpe состоит из 1342 уникальных генов (TM-10x: 332, TM-SS2: 531 и MCA: 479 генов) с 189 общими и прямыми мишенями.Активность Cebpe строго определена в гранулоцитах и ​​моноцитах, что согласуется с его известной ролью в детерминации клонов (рис. 3A) (37). Irf8 является главным регулятором моноцитов и дендритных клеток и важен как для адаптивного, так и для врожденного иммунитета (38). Мы наблюдали 641 общую мишень и удельную активность в моноцитах и ​​макрофагах (рис. 3B). Мы обнаружили, что регулоны с несколькими общими прямыми мишенями в клеточных атласах обладают специфической и постоянной активностью. У регулонов Lef1 и Hoxb7 меньше общих генов-мишеней, только пять общих мишеней для клеточных атласов, но со специфической активностью в Т-клетках (39) и эпителиальных клетках почек (40) соответственно.Несколько глобальных и специфичных для клеточного типа регулонов с дифференциальным составом представлены на рис. S18 – S20.

Состав и активность регулона в атласах лаз. (A, B, C, D) графиков Венна репрезентативных индивидуальных регулонов, составов генов, перекрываются в индивидуальном атласе и регуляции специфического типа клеток (A) Irf8, (B) Irf8, (C) Hoxb7 и (B) Lef1. Тепловая карта представляет собой среднюю оценку активности регулона в масштабе z для разных типов клеток.

Репрезентативные примеры перекрытия состава отдельных регулонов и активности регулонов в эталонных типах клеток в клеточных атласах. (A, B, C) Pou2af1 с несколькими общими генами-мишенями и обогащенными субпопуляциями B-клеток, (B) Eomes с редкими общими генами-мишенями, обогащенными NK-клетками, и (C) Tcf7 с большинством общих генов-мишеней, обогащенных Т-клетки.

Репрезентативные примеры перекрытия состава отдельных регулонов и активности регулонов в эталонных типах клеток в клеточных атласах. (A, B, C) Hsf1 без перекрывающихся генов и неспецифической регулонной активности, (B) Etv3 с множеством общих генов-мишеней и обогащенный типами клеток крови и (C) Mafb, обогащенный моноцитами и макрофагами.

Репрезентативные примеры перекрытия состава отдельных регулонов и активности регулонов в эталонных типах клеток в клеточных атласах. (A, B, C) Irf5 с несколькими общими генами-мишенями и специфически обогащенным подтипами иммунных клеток (B) Irf9, также с множеством общих генов-мишеней и обогащением по подмножествам иммунных клеток, и (C) активности Foxp1, обогащенные по B- клетки.

Для дальнейшей проверки нашей нормативной базы для анализа в масштабе атласа мы выполнили вывод GRN, используя альтернативный метод bigSCale2 с учетом атласа TM-10 × (41). Подход bigSCale2 использует корреляцию экспрессии для расчета регуляторной сети и не делает различий между прямыми и косвенными целями TF. Сравнивая два метода, мы обнаруживаем, что 117 регулонов (67%) совместно идентифицированы обоими методами, тогда как 57 регулонов (33% и прямые мишени внутри) захватываются исключительно в нашей структуре SCENIC (рис. S21A).Вычисляя индекс Жаккара, мы находим только 95 регулонов со сходным составом между обоими методами вывода GRN (рис. S21B). Таким образом, структура SCENIC четко определяет регулоны и их прямые цели для анализа в масштабе атласа. Мы также сравнили оценку GRN между SCENIC (AUCell) и альтернативным подходом (VIPER), который вычисляет нормализованную оценку обогащения (NES) на регулон для определенного типа (или группы) клеток путем сравнения с другими определенными типами клеток (42). Мы рассматриваем регулоны (GRNBoost и RcisTarget) через В-клетки из атласа TM-10 × для сравнения (рис. S22A и B).Хотя прямое сравнение между двумя подходами сложно из-за лежащих в основе методов оценки, мы построили график корреляции регулонов между оценками обогащения VIPER и средним значением RAS (NES по сравнению со средней AUC; рис. S22A). Однако корреляция значительно улучшается при рассмотрении показателей обогащения VIPER (42) с показателями специфичности регулона (21), что указывает на обогащение конкретного типа клеток (рис. S22B).

(A) Перекрытие регулонов и генов-мишеней, идентифицированное в этом исследовании (SCENIC: GRNBoost и RCisTarget) и повторный анализ с опубликованным методом регуляторной сети генов (bigSCale2 (41)) для TM-10 × атласа мыши. (B) Индекс Жаккара, подчеркивающий перекрытие между составом регулона, выведенным на атласе TM-10 × нашей структурой, и повторным анализом с помощью bigSCale2. Для простоты мы визуализируем регулоны с оценкой сходства Жаккара выше 0,005.

(A) Корреляция между AUCell и оценкой VIPER регулонов в B-клетках из TM-10 × атласа. Для каждого регулона ось x представляет площадь под кривой (AUC), вычисленную AUCell, тогда как ось y представляет нормализованный показатель обогащения, вычисленный с помощью VIPER. (B) Корреляция между оценкой специфичности регулона и нормализованной оценкой обогащения (VIPER) для каждого регулона в B-клетках из TM-10 × атласа. Каждая точка представляет собой регулятор, а заштрихованная область представляет 95% доверительный интервал от линии линейной регрессии.

Наконец, мы оцениваем функциональную важность активности регулона, исследуя переходы смешанных клонов во время определения судьбы миелоидных клеток с использованием scRNA-seq (43). Реглон Irf8 и его регуляторные взаимодействия являются критическими для монопоэза и имеют реципрокную динамику со спецификацией гранулоцитов, управляемой Gfi1 (43). Мы анализируем гранулоцитарную и моноцитарную спецификацию в предшественниках дикого типа и Irf8 ^{— / —} , используя данные scRNA-seq (фиг. S23A), выявляя регулоны и оценивая активность регулонов в отдельных клетках (фиг. S23B).Как подсчет экспрессии scRNA-seq, так и активность регулона разделяют разные типы клеток и фиксируют сдвиг в клетках Irf8 ^{— / —} в сторону гранулоцитарного происхождения (рис. S23A – D). Сравнивая регулон Irf8 в моноцитах, гранулоцитах и ​​клетках Irf8 ^{— / —} , мы наблюдаем преимущественно высокий состав прямых мишеней в моноцитах (542 гена) по сравнению с гранулоцитами (148 генов), что согласуется с ролями клеточной судьбы (рис. S23E) ( 43). Примечательно, что регулон Irf8 значительно нарушен как по составу (прямые гены-мишени), так и по активности (регуляция-мишень) в клетках Irf8 ^{— / —} (рис. S23D и E), что подчеркивает функциональную важность активности регулона в опосредовании состояний клеток и типы.

(A) Встраивание UMAP на основе одноклеточной экспрессии РНК-секвенирования из одиночных клеток дикого типа (множественные типы клеток) и Irf8 KO (или Irf8 — / -). (B) Встраивание UMAP на основе оценки активности регулона из отдельных клеток дикого типа (множественные типы клеток) и Irf8 KO. Пространство регулонов улавливает различия в типах клеток, как и пространство экспрессии. (C) Одноклеточная экспрессия Irf8 в миелоидных предшественниках из клеток дикого типа (включая моноциты и гранулоциты) и клеток с нокаутом Irf8 (Purple).Клетки Irf8 KO имеют градиентную экспрессию клеток с высоким и низким уровнем. (D) Активность регулона Irf8 в миелоидных предшественниках клеток дикого типа (включая моноциты и гранулоциты) и Irf8 KO клеток (Purple). Примечание: клетки Irf8 KO имеют пониженную оценку активности регулона (по сравнению с моноцитами, что соответствует изменению их спецификации с моноцитов на гранулоциты). Для расчета активности регулона Irf8 в клетках KO дикого типа и Irf8 мы повторили AUCell 50 раз и использовали усредненную оценку активности. (E) График UpSet состава регулона Irf8 в моноцитах дикого типа, гранулоцитах дикого типа и клетках Irf8 KO. Клетки с нокаутом Irf8 изменяют и определяют судьбу клеток от моноцитов до гранулоцитов, на что указывает радикально измененный состав регулонов в клетках Irf8 KO.

Сравнительный геномный подход к прогнозированию новых членов регулонов

1. Кай Тан1,
2. Габриэль Морено-Хагелсиб2,
3. Хулио Колладо-Видес2 и
4. Гэри Д.Стормо1,3

1. ¹ Департамент генетики Медицинской школы Вашингтонского университета, Сент-Луис, Миссури 63110-8232, США; ² Programa de Biolı́ogía Molecular Computacional, Centro de Investigacion Sobre Fijacion de Nitrogeno-UNAM, Cuernavaca, Morelos 62100, Мексика

Абстрактные

Идентификация полной регуляторной сети транскрипции для организма является серьезной проблемой.Для каждого регуляторного белка мы хотим знать все гены, которые он регулирует, то есть его регулон. Примеры известных сайтов связывания можно использовать для оценки специфичность связывания белка и прогнозирование других сайтов связывания. Однако прогнозы сайта привязки могут быть ненадежными. потому что определение истинной специфичности белка затруднено из-за значительной вариабельности сайтов связывания. Поскольку регуляторные системы, как правило, сохраняются в процессе эволюции, мы можем использовать сравнения между видами, чтобы увеличить надежность прогнозов места привязки.В этой статье представлен подход к оценке вычислительных прогнозов. нормативных сайтов. Мы сочетаем предсказание единиц транскрипции, имеющих ортологичные гены, с предсказанием транскрипции. сайты связывания факторов на основе вероятностных моделей. Мы увеличиваем наборы генов в Escherichia coli , которые, как ожидается, будут регулироваться двумя факторами транскрипции, белком рецептора цАМФ и восстановлением фумарата и нитрата. регуляторный белок, путем сравнения с геномом Haemophilus influenzae .В то же время мы узнали больше о регуляторных сетях H. influenzae , вида с гораздо меньшими экспериментальными знаниями, чем E. coli . Изучая ортологичные гены, регулируемые одним и тем же фактором транскрипции, мы также получили понимание эволюция всей системы регулирования.

Число полных последовательностей микробного генома растет с беспрецедентной скоростью.На сегодняшний день 29 бактериальных геномов имеют определены, еще 11 находятся в стадии аннотации, а 83 находятся в стадии разработки. Этот всплеск информации о последовательности обеспечивает огромное объем данных для сравнительного анализа геномики. На более раннем этапе геномного анализа большая часть усилий была посвящена к анализу областей, кодирующих белок, потому что в процессе эволюции последовательности, кодирующие белок, изменяются намного медленнее, чем некодирующие последовательности (Koonin et al.1997, 1998). Эти сравнительные исследования геномики оказались очень информативными, позволяя функционально назначать многие предполагаемые белки. у малоизученных организмов (Overbeek et al. 1999). Одним из неожиданных результатов этих анализов было отсутствие долгосрочного сохранения порядка генов в бактериальных геномах, с исключение видов внутри того же рода (Tatusov et al. 1996; Himmelreich et al. 1997). Для видов с промежуточной филогенетической дистанцией, таких как Escherichia coli и Haemophilus influenzae , многие кластеры консервативны, но их порядки менее консервативны (Dandekar et al.1998). Однако более недавнее исследование показывает четкую консервацию пар ортологов генам внутри оперона, в отличие от гены на границах единиц транскрипции (TU) (G.Moreno-Hagelsieb et al. 2001).

Помимо знания индивидуальных функций белков, знание о сети регуляции транскрипции является необходимым предварительным условием. для адекватного понимания клеточных функций. Вычислительная идентификация регуляторных белков бактериального последовательность генома более прочная, учитывая ограниченное количество семейств факторов транскрипции и сохранение спирали-поворота-спирали. мотив у бактерий (Perez-Rueda and Collado-Vides 2000).Для набора регуляторных белков мы хотим знать весь набор генов, экспрессия которых регулируется каждым из них. регуляторы, его регулон (Salgado et al. 2000a). Первым шагом в этом направлении является идентификация сайтов связывания факторов транскрипции, которые затем могут помочь предсказать единицы транскрипции, регулируемые этими белками. Хотя проблема прогнозирования регуляторных площадок изучается более 20 лет. лет, она все еще далека от решения (Gelfand 1995; Thieffry et al.1998а). Основными причинами этого являются небольшой размер обучающей выборки (часто <20 последовательностей) и плохое понимание биофизики белок-ДНК взаимодействие, что делает очень трудным вывести правильный набор правил для алгоритмов распознавания образов.

Помимо определения регуляторных сайтов, другим ключом к предсказанию новых членов регулона является хорошая оценка транскрипции. единиц в данном геноме. Однако даже для такого хорошо изученного организма, как E.coli , набор известных TU далек от полного (Salgado et al. 2000a). Кроме того, прогнозирование TU — нетривиальная проблема, которая не изучалась широко. Недавно три группы опубликовали новые методы прогнозирования ЯП (Yada et al. 1999; Craven et al. 2000; Salgado et al. 2000b). Эти исследования представляют собой многообещающий первый шаг к более точному прогнозированию ЯП. В этой статье транскрипция единицы определяются как наборы генов (один или несколько), котируемых котранскрибируемыми.Опероны определяются как полицистронное подмножество (подробнее чем один ген) всех единиц транскрипции.

Мы приняли комбинированный подход к выявлению новых членов регулонов. Мы обнаружили, что высокие баллы соответствуют шаблонам привязки Факторы транскрипции, вероятно, представляют собой реальные регуляторные сайты на основе распределения таких сайтов. Предсказания участков с более низкой оценкой менее надежны, поэтому мы добавляем данные сравнительного анализа с другими видами, основанные на предпосылка, что регулоны имеют тенденцию к сохранению.Если мы обнаружим, что ортологичные гены у двух или более видов, по-видимому, находятся под контролем тем же фактором, что обеспечивает дополнительную уверенность в предсказании даже сайтов с более низким рейтингом. Однако, поскольку многие прокариотические гены транскрибируются как опероны, области контроля транскрипции могут быть далеко удалены от конкретного гена. Следовательно, анализ TU важен для идентификации пар ортологичных генов, принадлежащих к общим регулонам.Таким образом, общий подход сочетает в себе прогнозирование ТЕ у каждого вида, идентификацию ортологичных генов и предсказание сайтов связывания факторов транскрипции на основе вероятностных моделей, таких как весовые матрицы.

В этой статье мы прогнозируем появление новых членов рецепторного белка цАМФ (CRP) и регулирующего белка фумарата и восстановления нитратов. (FNR) регулонов в E. coli и H.грипп . Мы выбрали эти два генома, потому что регуляция транскрипции E. coli , безусловно, лучше всего изучена среди всех видов бактерий, а H. influenzae — единственный полный геном (на момент написания этой статьи), который достаточно близок, чтобы многие TU были законсервировано. CRP и FNR два глобальных регулятора транскрипции, которые встречаются у многих бактерий. Регулируемые ими гены (регулоны CRP и FNR) имеют широкий набор функций. Наша общая стратегия показана на Рисунке 1.Вкратце, паттерны связывания, полученные из известных последовательностей связывания CRP и FNR E. coli , используются для предсказания новых сайтов связывания для этих двух белков. Предполагаемые сайты связывания в сочетании с нашими знаниями об ортологичных генах и предсказаниями TU в обоих геномах. Эта комбинированная информация используется для прогнозирования новых членов регулонов CRP и FNR.

Блок-схема, изображающая нашу общую стратегию прогнозирования дополнительных членов CRP и FNR регулонов. Подход разделен на три этапа. На первом этапе (I) необработанные наборы данных из RegulonDB фильтруются на предмет сильных сайтов связывания и веса. матрицы на основе этих сильных сайтов генерируются. В этой части диаграммы показаны две пары чисел; первая пара — данные CRP и данные FNR второй пары.Внутри каждой пары номеров первое число — это количество единиц, регулируемых конкретным фактор транскрипции, а второе число — количество сайтов связывания фактора транскрипции. На втором этапе (II) Регуляторная область (от -400 до +50 п.н.) каждой ORF в обоих геномах (4289 в E. coli и 1709 в H. influenzae ) ищется PATSER на предмет потенциальных сайтов связывания факторов транскрипции. Пороговые значения для сильного (17 для CRP и 20 для FNR) и слабого (10 для CRP и 14 для FNR) сайтов связывания выбраны.Для дальнейшего анализа используются только спрогнозированные участки с оценкой выше пороговых значений слабых участков. Количество предполагаемых сайтов связывания CRP и FNR, оцененных выше пороговых значений, показано для обоих геномов. Первая пара чисел представляют собой сайты CRP и вторые сайты FNR. На третьей стадии (III) единицы транскрипции после предсказанных сайтов связывания предсказано, и определены ортологические отношения между генами в единицах транскрипции E. coli и H. influenzae .Наконец, оценки сайта и информация об ортологии используются вместе для классификации наших прогнозов. ТУ — единица транскрипции; ТФ, фактор транскрипции.

Другие группы ранее использовали сравнительный анализ для предсказания новых наборов регулируемых генов. McGuire et al. (2000) недавно исследовали 17 полностью секвенированных микробных геномов для определения регуляторных участков для групп родственных генов.Они использовали подход обнаружения шаблонов для поиска предполагаемых сайтов, а затем использовали различные методы фильтрации, чтобы уменьшить количество ложных предсказаний. Они использовали известные регулоны E. coli в качестве положительного контроля и показали, что метод хорошо помогает идентифицировать известные сайты. Они даже показали, что метод может быть применен к архебактериальным видам, как в другой статье Гельфанда и др. (2000). Однако они не использовали образцы для E.coli для расширения набора генов, которые могут регулироваться конкретными факторами, что является основной целью этого статья. Миронов и др. (1999) также использовали сравнительный анализ для предсказания регуляторных сайтов у других видов для нескольких регулонов в E. coli . Кроме того, они действительно предсказали несколько новых сайтов в E. coli для PurR и ArgR регуляторных белков. Наш подход в этом исследовании был аналогичным, но за счет включения прогноза TU и Используя два хорошо изученных регулона, мы смогли предсказать еще много новых членов регулонов CRP и FNR.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сохраненные паттерны распознавания с помощью CRP и FNR в обоих геномах

Сокристаллическая структура комплекса E. coli CRP – ДНК была решена с разрешением 2,5 Å (Parkinson et al. 1996). Основные придающие специфичность взаимодействия — это взаимодействия между первыми двумя остатками спирали узнавания, R180. и E181, и две пары G: C в выведенном консенсусном полупространстве TGTGA (Ebright et al.1989; Gunasekera et al. 1992). Остаток R185 в спирали узнавания также вносит вклад в специфичность связывания, хотя и в меньшей степени (рис. 2). Мы выровняли 10 ортологов CRP из разных бактериальных геномов (рис. 3). Первые два остатка придающего специфичность мотива RE-R на 100% консервативны для всех видов. Третий остаток в мотиве консервативен, за исключением CRP_MTB, в котором второй аргинин заменен на лизин. Этот высокий уровень сохранения в ДНК-связывающем домене подразумевает образец связывания CRP, аналогичный таковому у E.coli . CRP также существует в этих бактериальных геномах с родственным белком CRP.

Схематическое изображение обеспечивающих специфичность взаимодействий между узнающими спиралями (спираль 2) белков CRP и FNR E. coli и их консенсусными мотивами связывания на полусайтах. CRP, белок рецептора цАМФ; Восстановление FNR, фумарата и нитратов регуляторный белок.

Множественное выравнивание последовательностей белков CRP и FNR из различных бактериальных геномов. Только последовательности вокруг второй спирали мотива спираль – поворот – спираль. Границы второй спирали обозначены сплошной линией.В высшей степени консервативный Мотив RE-R в белке CRP и мотив E-SR в белке FNR заштрихованы. FNR_AAC, FNR_COC и FNR_HAH являются частичными последовательностями, производными от гомологического клонирования (Hattori et al. 1996). (AAC) Actinobacillus actinomycetemcomitans ; (БГУ) Bacillus subtilis ; (COC) Capnocytophaga ochracea ; (ECO) Escherichia coli ; (HAH) Haemophilus aphrophilus ; (HIN) Haemophilus influenzae ; (HSO) Haemophilus somnus ; (KAE) Klebsiella aerogenes ; (KPN) Klebsiella pneumoniae ; (MTB) Mycobacterium tuberculosis ; (PHA) Pasteurella haemophilus серотипа 1; (PMU) Pasteurella multocida ; (SDY) Shigella dysenteriae ; (STM) Salmonella typhimurium ; (ВЧ) Холерный вибрион .CRP, белок рецептора цАМФ; FNR, белок, регулирующий восстановление фумарата и нитрата.

И CRP, и FNR принадлежат к суперсемейству факторов транскрипции спираль – поворот – спираль CRP / FNR. В E. coli два белка идентичны на 23% и схожи на 36%, причем консервативность сосредоточена в домене, содержащем HTH. мотив, в котором они имеют 27% идентичности и 43% сходства (с использованием BLAST и BestFit ).Консенсусный мотив полусайта FNR (Spiro et al. 1990), TTGAT, аналогичен мотиву полусайта CRP (TGTGA). Фактически, сообщалось об общем сайте, который может связывать как FNR, так и CRP. (Дженнингс и Бичем, 1993). В E. coli предполагаемые взаимодействия, придающие специфичность для FNR, — это взаимодействия между E209 и парой оснований G-C, общей для обоих ядер. мотивов и дискриминационное взаимодействие между S212 и первой парой оснований T-A в сайте FNR, которое заменяет взаимодействие между R180 и общая пара оснований G-C в сайте CRP.Другое консервативное взаимодействие включает R213 и общую пару оснований G-C. (Рис.2). Из множественного выравнивания восьми ортологов FNR (рис. 3) мы видим, что первый и третий остатки придающего специфичность мотива, E – SR, абсолютно консервативны по всей длине. видов, тогда как второй остаток в высшей степени, но не абсолютно консервативен. Опять же, эта высокая степень сохранения последовательности подразумевает консервативный шаблон распознавания для связывания FNR с его операторами.

Матрицы весов CRP и FNR, полученные выравниванием охарактеризованных последовательностей связывания в

Используя программу CONSENSUS (Hertz and Stormo 1999), мы выровняли последовательности обучающего набора для создания весовых матриц, используемых программой PATSER . В частности, для представления специфичности связывания фактора транскрипции использовали мононуклеотидную матрицу.Предположение при использовании такой матрицы вклады в специфичность связывания складываются по всем позициям сайта. Мы протестировали это предположение с помощью программы MIXY (Gutell et al. 1992), которая может идентифицировать ковариацию (я) между любыми двумя положениями в сайтах связывания. Никакой значительной ковариации не наблюдалось. между позициями для CRP и FNR. Таким образом, мы считаем, что мононуклеотидная матрица является достоверным представлением связывания особенности CRP и FNR.

CONSENSUS вычисляет значение P для множественного выравнивания без пропусков, поэтому можно сравнивать различные выравнивания и определять наиболее значимое. (Герц и Стормо, 1999). Для каждого белка мы сравнили длину сайтов от 14 до 28 нуклеотидов и сравнили симметричные модели с асимметричными. единицы. Симметричные модели явно более значимы, чем асимметричные, с ожидаемыми значениями, по крайней мере, в 10 ² раза ниже при всех протестированных длинах.Ожидаемые значения для разной длины не сильно различались на всем протяжении диапазон тестируемых длин, соответствующий белкам, имеющим консервативную область ядра из 16 или 14 п.н., для CPR и FNR, соответственно, окружены более слабо консервативными последовательностями. Мы использовали 22 нуклеотида для длины сайта связывания каждого белка на основе по предыдущей работе (Kolb et al. 1993) и для согласованности с предыдущими анализами (Salgado et al. 2000a).Белок CRP имеет консенсус полусайтов TGTGA с разделением шести нуклеотидов между двумя полусайтами. В Белок FNR имеет консенсус полусайтов TTGAT с разделением четырех нуклеотидов между полусайтами (фиг.4; таблица 1).

Логотипы последовательностей для CRP- и FNR-связывающих мотивов.Он был создан на основе множественных выравниваний последовательностей с помощью CONSENSUS с использованием обучающих последовательностей. (горизонтальная ось) Положение в мотиве переплета; (вертикальная ось) информационное содержание в биты. Высота каждой буквы пропорциональна ее преобладанию в данной позиции.

Матрицы позиционных весов для связывающих мотивов CRP и FNR

Определение пороговых баллов для сайтов CRP и FNR

Для определения соответствующей матрицы весов для каждого фактора транскрипции и пороговых значений, которые будут использоваться для сильных и слабых предсказанных сайтов, нам нужно было определить надежный набор примеров сайтов и распределение оценок для этих сайтов, а также потенциальные сайты в геноме.Одна из трудностей возникает из-за того, что факторы транскрипции могут кооперативно связываться с ДНК. так что конкретный экспериментально определенный сайт на самом деле не будет сайтом с высоким сродством к фактору в другом контекст без соседнего сайта. Чтобы исключить такие потенциальные артефакты, мы выбрали для каждого сайта только самый высокий рейтинг. единица транскрипции (см. Методы), предполагая, что хотя бы один из сайтов сам по себе должен обладать высокой аффинностью.Это все еще может приведет к появлению нескольких сайтов с изначально низкой аффинностью в нашей обучающей выборке, но следует свести это число к минимуму. Затем мы устанавливаем пороги для сайтов с высокими баллами на основе баллов обучающих наборов и с учетом распределения баллов в фоновая (т.е. геномная) последовательность.

Чтобы определить пороговые значения для сайтов CRP, мы использовали следующую процедуру.Сначала мы определили диапазон и средний балл для следующие два набора последовательностей: (1) обучающие последовательности; и (2) все 22 мера в геноме E. coli . Как показано в Таблице 2, обучающие последовательности набрали от 8,77 до 20,62 бита со средним значением 14,4 бита и стандартным отклонением 3,6 бита. В средний балл и стандартное отклонение всех 22 меров в геноме E. coli составляли -15,84 и 8,53 бит, соответственно. Такой отрицательный средний балл ожидается, потому что большая часть геномной последовательности не содержит сайтов связывания CRP.Затем для каждого сайта с оценкой от 7 до 23 бит по результатам полногеномного сканирования мы определили его расположение относительно блоков TU, расположенных ниже по потоку от него или в его окружении. Функциональные регуляторные участки обычно расположены выше по течению TU (в регуляторном регионе), хотя известно несколько случаев, когда сайты расположены в TU (8 из 361 в RegulonDB). Учитывая это наблюдение, мы можем приблизительно оценить количество ложных срабатываний прогнозов нашего сайта на основе доли предсказанных сайтов, расположенных в единицах транскрипции.На рис. 5а показана доля сайтов связывания CRP, расположенных выше или внутри TU в геноме E. coli . При низких оценках отсечения почти все сайты расположены в единицах транскрипции, что указывает на высокий уровень ложноположительных результатов. Размер всех вышележащих областей составляет ~ 1,23 МБ, ~ 27% от размера генома E. coli (4,63 МБ). Таким образом, сайты со случайной локализацией встречаются в ~ 73% случаев внутри TU. Повышение оценки отсечки уменьшает доля предсказанных сайтов, расположенных в пределах TU, и, таким образом, снижает количество ложноположительных результатов.Используя отсечку 17 бит, только 6% всех сайтов расположены в единицах транскрипции, что указывает на низкую частоту ложноположительных результатов на этом пороге. Таким образом, мы использовали 17 как пороговый балл для сильных сайтов. Чтобы повысить чувствительность поиска, мы также выбрали пороговую оценку для слабых сайтов. Мы решили использовать порог, при котором более половины всех сайтов расположены выше TU. Как показано на рисунке 5a, при отсечении 10 битов 56% всех сайтов расположены выше, чем внутри блоков TU.Таким образом, мы выбрали 10 в качестве порогового значения. оценка слабых сайтов. Используя эту отсечку слабого сайта, мы пропустили только две обучающие последовательности (glnALG и rpoS; Таблица 3).

Распределение оценок сайтов обучающих последовательностей и всех 22-Mers в обоих геномах, сканированных с помощью PATSER

Доля сайтов, расположенных выше или внутри TU в E. coli . Все сайты в геноме E. coli выше определенного отсечения делятся на две группы в соответствии с их расположением относительно TU: перед или внутри. ( a ) сайты CRP; ( b ) Сайты ФНР. ТУ, единица транскрипции.

Учебный набор TU, регулируемый CRP

Мы применили те же критерии, описанные выше, для определения показателей отсечения для сайтов связывания FNR. Последовательности обучения имел диапазон оценок от 12 до 25,84 бит и среднее значение 19,8 бит со стандартным отклонением 4,5 бит (таблица 2). На основании рисунка 5b мы выбрали 20 в качестве порогового значения для сильных сайтов.При этом пороговом значении только 9% всех сайтов расположены в пределах ЕП. Что касается слабых мы выбрали 14, потому что при этом пороге более половины всех сайтов (57%) расположены выше, чем внутри ТУ (рис. 5б). Используя отсечение слабых сайтов, мы пропустили только одну обучающую последовательность (dmsA; таблица 4).

Учебный набор TU в Escherichia coli Регулируется FNR

Новые члены CRP Regulon

Наборы вышестоящих последовательностей из обоих геномов сканировали с помощью PATSER с использованием весовой матрицы CRP.Предполагаемые сайты были отфильтрованы с использованием двух пороговых значений для сайтов CRP, описанных выше. Для каждого Сайт CRP набрал более 10 бит, мы предсказали TU ниже по течению. Ортологи (если таковые имеются) ко всем генам в предсказанной TU были идентифицированы. Основываясь на двух пороговых значениях для сайтов связывания CRP, мы сначала разделили наши прогнозы на следующие две категории: (1) ЕП, имеющие хотя бы один надежный сайт; и (2) TU, имеющие только слабый сайт (ы). Потому что порог для сильных сайтов равен 2.6 битов выше, чем средний балл обучающих последовательностей, и, вероятно, будут иметь несколько ложноположительных результатов (рис. 5а), мы были уверены в этих предсказаниях категории I даже без информации об ортологии. Прогнозы в категории II имеют только слабые сайты связывания и они менее надежны, чем в категории I. Однако для некоторых прогнозов категории II дополнительные существуют доказательства, подтверждающие их. Первый тип свидетельств — это информация об ортологии.Если ТУ категории II разделяет ортологичные член (ы) с TU из другого генома, и последний также имеет сайт (ы) связывания CRP (слабый или сильный), мы помещаем такие ТУ категории IIA. Второй тип доказательств — наличие двух или более слабых сайтов связывания в регуляторной области. ТУ. Вероятность того, что два или более сайта случайно окажутся в непосредственной близости, довольно мала. Мы исследовали все слабые СРБ. сайты в E.coli геном. Для всех сайтов, расположенных выше TU, 12% находятся в пределах 100 нуклеотидов друг от друга. И наоборот, только 2% всех сайтов в пределах TU находятся в пределах 100 нуклеотидов друг от друга. Таким образом, близко расположенные тандемные сайты в регуляторной области более вероятны. быть истинными сайтами связывания, чем один слабый сайт в регуляторной области. Мы помещаем все прогнозы категории II с двумя или больше сайтов, но без ортологической информации в категории IIB.Остальные прогнозы категории II, у ЕП есть только один слабый сайт связывания и отсутствие информации об ортологии помечены как категория IIC. У этой категории меньше всего подтверждений. Таким образом, мы ожидаем высокого уровня ложноположительных результатов среди прогнозов категории IIC.

Для наглядности 46 обучающих наборов TU и H. influenzae TU, имеющих ортологи генов в обучающем наборе, были помещены в отдельную категорию.Для 46 E. coli TU наши прогнозы сайтов связывания CRP в значительной степени совпадали с данными в RegulonDB, за исключением нескольких случаев, в которых наш метод предсказал дополнительные сайты связывания (Таблица 3). Мы идентифицировали 23 единиц H.influenzae , которые имеют ортологи генов в обучающих наборах единиц. Из этих 23 TU только семь содержат сайты связывания CRP в своих районы верховья (рис.6; таблица5)

Учебный набор TU, регулируемый CRP и FNR, и H. influenzae TU, содержащие ортологи генов в обучающем наборе. Гены в TU представлены прямоугольными прямоугольниками. Связывающие сайты Представлены квадратными прямоугольниками, серым прямоугольником — слабый узел и черным прямоугольником — сильным узлом. Расстояние между сайтом связывания и началом трансляции пропорционально реальному расстоянию в геномной последовательности.Коробки с генами и расстояния между генами не пропорциональны. Ортологическое родство обозначено сплошной линией между двумя генами. вовлеченный. (+ и -) Нити транскрипционной единицы. EC, E. coli ; HI, H. influenzae; CRP, рецепторный белок цАМФ; FNR, белок, регулирующий восстановление фумарата и нитрата.

Haemophilus influenzae TU, предположительно принадлежащих CRP Regulon

В категории I мы предсказали 62 и 49 TU у E. coli и H. influenzae соответственно. В категории IIA мы прогнозировали 30 и 21 TU в E.coli и H. influenzae соответственно. Для обеих категорий предполагаемые сайты CRP, их баллы и местоположения относительно начала транскрипции. приведены в таблице 6 ( E. coli ) и таблице 5 ( H. influenzae ). Категория IIB содержит 25 и 12 TU в E. coli и H. influenzae соответственно. Это в общей сложности 117 и 82 новых TU в E. coli и H. influenzae соответственно, которые, как мы с достаточной уверенностью уверены, принадлежат регулону CRP.Категория IIC содержит 319 и 150 TU в E. coli и H. influenzae соответственно. Эти прогнозы менее надежны, но, вероятно, содержат некоторые истинные регулируемые ЕП. Из-за нехватки места в этой статье мы не можем отображать результаты категорий IIB и IIC. Эти данные доступны в качестве дополнительных материалов. на http://www.genome.org.

Escherichia coli TUs, предположительно принадлежащих CRP Regulon

На рисунке 7 мы изображаем структуры предсказанных TU, которые имеют общие ортологичные члены. Они принадлежат к категориям I и IIA в обоих геномах. Сайты сильного и слабого связывания представлены черными и серыми квадратами соответственно.Таким образом, можно выделить категорию которому принадлежит ТУ по цвету квадратов места привязки.

Ортологических пар TU из категорий I и IIA, которые, по прогнозам, регулируются CRP и FNR. Показаны ЕП, регулируемые CRP. сначала следуют ТП, регулируемые ФНР. Условные обозначения и схемы чертежей соответствуют рисунку 6.CRP, белок рецептора цАМФ; FNR, белок, регулирующий восстановление фумарата и нитрата.

Новые члены ФНР Регулон

Те же процедуры (предсказания FNR-связывающего сайта, предсказания нисходящих TU и категоризация) были выполнены для идентификации новые члены регулона ФНР.У нас есть девять обучающих наборов TU (Таблица 4) и четыре H. influenzae TU, которые имеют ортолги к генам в обучающем наборе. Среди этих четырех H. influenzae TU только одна все еще поддерживает регуляцию FNR (рис. 6; таблица 7). Остальные пять TU E. coli не имеют поддающихся обнаружению ортологов в H. influenzae .

Haemophilus influenzae TU, предположительно принадлежащих FNR Regulon

Категория I содержит 10 и восемь TU в E.coli и H. influenzae соответственно, каждая из которых имеет по крайней мере один сильный сайт. Категория IIA содержит 0 и 2 TU в E. coli и H. influenzae соответственно. Для обеих категорий предполагаемые сайты FNR, их баллы и расстояния относительно начала транскрипции. приведены в Таблице 7 ( H. influenzae ) и Таблице 8 ( E. coli ). Мы не обнаружили никаких ТУ в категории IIB у E. coli . В H. influenzae категория IIB содержит 2 TU.Таким образом, это всего 10 и 12 новых TU в E. coli и H. influenzae соответственно, которые, как мы уверены, принадлежат регулону FNR. В категории IIC мы предсказали 70 E. coli и 79 H. influenzae TU, все из которых имеют только один слабый сайт связывания и никакой информации об ортологии. Категории IIB и IIC доступны как дополнительные. материал на http://www.genome.org. Опять же, структуры предсказанных TU, которые имеют общие ортологичные члены, изображены на Рисунке 7.

Escherichia coli TUs, предположительно принадлежащих FNR Regulon

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы описали метод систематического поиска дополнительных членов бактериальных регулонов на основе информации как внутреннее и внешнее по отношению к данному геному.Внутренняя информация состоит из сайтов и структур связывания факторов транскрипции. нижестоящих ТУ. Внешняя информация — это ортологическое отношение между TU, полученное путем сравнения соответствующих полные наборы генных продуктов. Наш сравнительный подход состоит из следующих трех основных шагов: (1) получение распознавания ДНК. образец для данного регуляторного белка; в этом исследовании мы использовали весовые матрицы для представления паттернов сайтов связывания; (2) предсказание сайтов связывания факторов транскрипции с использованием паттерна распознавания, полученного на первом этапе; и (3) прогнозирование TU в нисходящем направлении. от сайтов связывания с шага два и идентификации любых ортологов к членам предсказанных TU.При низких порогах транскрипция прогнозирование сайта связывания фактора любым современным компьютерным алгоритмом, как ожидается, будет иметь относительно высокий уровень ложноположительных результатов. скорость из-за небольшого размера обучающего набора и плохого сохранения некодирующих последовательностей. Однако включение ортологической информации на третьем шаге повышается надежность наших выводов. Еще одно подкрепление к предсказанию регулирующих сайтов: использование информации о ТУ.Соответствие между прогнозируемыми TU и назначением предполагаемых регулирующих сайтов будет помочь найти другие средства оценки прогнозов и сделать их более надежными. Конечно, у нас нет статистической модель для оценки того, насколько увеличивается вероятность сайта, когда сайт присутствует перед ортологичными TU. Однако, качественно наша уверенность возрастает при наличии ортологической информации. Таким образом, мы как минимум уверены что прогнозы в категориях IIA и IIB имеют более низкий уровень ложноположительных результатов по сравнению с прогнозами в категории IIC.

Трудно определить чувствительность и специфичность наших прогнозов, потому что мы не знаем полного набора генов. которые регулируются CRP и FNR у любого вида. В E. coli у нас есть набор генов, которые, как известно, регулируются каждым белком на основе генетических и биохимических критериев, но которые комплект конечно неполный. Для большинства генов мы просто не знаем, регулируются ли они CRP или FNR, а первичный Целью данной статьи было выявить новые ЕП, которые, вероятно, будут регулироваться этими факторами.Мы можем оценить чувствительность и меры специфичности с использованием как известного набора регулируемых генов, так и некоторых предположений о распределении сайтов с разными оценками. Например, мы знаем, что функциональные регуляторные сайты обычно находятся в области, которую мы определили как расположенная выше область между -400 и +50 п.н. от начала трансляции первого гена в TU. Редко, но иногда функциональные сайты располагаются либо дальше по течению от TU, либо внутри нее.Мы также предполагаем, что если сайт связывания для нормативного белок находится в этой области, расположенной выше по течению, тогда он, скорее всего, участвует в регуляции соседних TU. Мы установить порог, основанный на этих предположениях, для сильных сайтов так, чтобы> 90% сайтов находились в регионах, расположенных выше по течению, и поэтому мы ожидаем очень мало ложноположительных прогнозов категории I. Это вселяет в нас уверенность в новом прогнозе. TU категории I, регулируемые CRP, 62 и 49 в E coli и H.influenzae соответственно, даже без дополнительных доказательств. Новые предсказания категории I для FNR — 10 и 8. Однако из известных TU E. coli , регулируемых этими белками, только 9 и 6 имеют сильные сайты, поэтому чувствительность, основанная только на сильных отсечениях сайтов, составляет только 16,1% и 46,2% для CRP и FNR соответственно.

Порог для слабых сайтов был выбран таким, чтобы> 50% приходилось на районы, расположенные выше по течению.Помните, что даже эти слабые сайты имеют гораздо более высокие оценки, чем средний фоновый сайт (Таблица 2), и что в большинстве вышестоящих регионов их нет, и любые случайно выбранные сайты будут встречаться только 27% времени в восходящие области, в зависимости от размеров двух наборов последовательностей. Следовательно, даже такие слабые сайты, предсказания категории II, являются вероятно, будет содержать много функциональных сайтов, но, несомненно, также содержать ложноположительные результаты. Поэтому мы ищем дополнительные доказательства, прежде чем считать их надежными.Одним из дополнительных доказательств является то, что TU в H. influenzae , содержащие ортологичные гены, также, по-видимому, регулируются фактором с сильным или слабым сайтом, который мы называем категория IIA. Другой тип — наличие двух слабых сайтов рядом друг с другом, который мы называем категорией IIB. Мы знаем, что CRP может связываются кооперативно, поэтому соседние слабые сайты могут иметь комбинированное сродство, сравнимое с одиночными сильными сайтами. Кроме того, поблизости пары слабых сайтов нечасто встречаются внутри TU, но относительно часто в вышележащих регионах, что и ожидается от функциональных нормативные сайты.Комбинируя категории IIA и IIB, мы прогнозируем 55 и 33 новых TU, регулируемых CRP, в E. coli и H. influenzae . Еще 319 и 150 TU относятся к категории IIC, некоторые из которых, вероятно, являются настоящими, а некоторые — ложными. Для FNR мы прогнозируем 0 и 4 новых БП в E. coli и H. influenzae из категорий IIA и IIB, а также имеются дополнительные 70 и 79 БП категории IIC.

Мы можем оценить чувствительность нашего подхода, оценив известные TU для каждого регулона.Для 56 ТЕ в Регламенте CRP которые мы извлекли из RegulonDB, только девять из них попали в категорию I. Еще 41 имеет слабые сайты и, следовательно, отнесен к категории II, что дает комбинированную чувствительность 89,3% (50/56). Однако среди 41 ЕП со слабыми сайтами, только 16 относятся к категориям IIA и IIB (шесть и 10, соответственно), а остальные 25 — к категории IIC. Поэтому наши уверенные прогнозы, объединяющие категории I, IIA и IIB, учитывают только 25 известных сайтов, чувствительность только 44.6%. Если то же самое пропорции существуют во всем геноме, тогда многие сайты категории IIC будут функциональными регуляторными сайтами CRP; Однако, мы не можем определить, какие из них истинны, а какие нет, из текущих данных. Аналогичные результаты получены для FNR, в котором категории I и II вместе составляют 11 из 13 известных TU с чувствительностью 84,6%, но пять из них относятся к категории IIC.

Конечный результат нашего анализа — это прогноз 116 и 10 новых CRP и FNR TU в E.coli , которые мы считаем высоконадежными, поскольку они попадают в категории I, IIA и IIB. Это явно не все гены регулируется этими факторами, потому что некоторые из известных TU отсутствуют в таких прогнозах. Функциональные сайты могут быть упущены потому что эти факторы взаимодействуют с некоторыми другими факторами, которые не включены в анализ, или потому что вес матрица не является достаточно хорошим описателем специфичности связывания белков, чтобы получить все функциональные сайты.Многие из отсутствующие сайты можно найти в предсказаниях категории IIC, но эти предсказания, вероятно, также содержат много ложных предсказаний, и мы не включаем их в наш надежный набор. Тем не менее, вычислительный подход, который мы применили в этой статье, имеет значительно увеличил набор TUs, которые могут регулироваться этими факторами в E. coli , с высокой, но не идеальной чувствительностью. Кроме того, мы делаем 82 и 12 надежных прогнозов TU, регулируемых CRP и FNR. в H.influenzae , большинство из которых ранее не были идентифицированы как члены этих регулонов.

Интересно, что один экспериментально подтвержденный сайт CRP существует в RegulonDB для оперона E. coli glpABC. Однако это слабый сайт (6,2 бита). В этом исследовании мы обнаружили еще один сильный сайт CRP для этого оперона. (17,25 бит; таблица 6). Другой интересный случай — это оперон E.coli fucAO.До этого исследования существовали только генетические доказательства в поддержку регуляции этого оперона с помощью CRP. В нашем исследовании мы идентифицировали три сайта связывания CRP перед fucA (рис. 7; таблица 6), что дает дополнительные доказательства предыдущих наблюдений.

В E. coli ген ansB находится под двойной регуляцией CRP и FNR (Scott et al. 1995). Эта совместная регуляция обоими факторами транскрипции может быть важна для достижения оптимальной экспрессии генов.На основе Согласно нашему анализу, ansB может регулироваться только CRP в H. influenzae , потому что сайт FNR с наивысшей оценкой в ​​регуляторной области H. influenzae ansB составлял всего 9,74 бит. Это намного ниже, чем отсечка слабых сайтов для FNR, но все же может быть функциональным сайтом. Два других TUs, ung и yfiD (его ортолог в H. influenzae — HI0017), по-видимому, регулируются в обоих геномах двояко. Интересно, что для обоих TU сайт CRP совпадает с сайтом FNR. в обоих геномах с E.coli TU с дополнительным сайтом FNR. Возможно, что эти сайты верны только для одного из регуляторов и являются ложноположительными. для другого регулятора. И наоборот, мы не можем исключить возможность того, что эти сайты действительно признаны обоими регуляторами, потому что некоторые сайты, которые могут связывать CRP, также могут связывать FNR (Sawers et al. 1997).

Отрицательная ауторегуляция довольно доминирует у E.coli , и его можно рассматривать как гомеостатическую роль для регуляторных генов (Thieffry et al. 1998b). Основываясь на наших результатах, кажется, что CRP не саморегулируется в H. influenzae (сайт CRP с наивысшей оценкой имел оценку 4,6 бит). Напротив, FNR, по-видимому, саморегулируется у H. influenzae.

Основываясь на нашем сравнительном анализе регулонов CRP и FNR в двух геномах, мы заметили три типа структурных изменений в оперонах, которые подчиняются одному и тому же режиму регуляции.Первый тип включает вставку или удаление отдельных генов. в других консервативных оперонах. Примеры в E. coli включают опероны glpTQ (glpT в H. influenzae , рис. 6), fnr (fnr-HI1426 в H. influenzae , рис. 6) и b2736-b2737 (HI1010-HI1011- HI1012-HI1013 в H. influenzae , рис 7.).

Второй тип изменений включает разбиение оперона в одном геноме на несколько более мелких в другом геноме.Не все более мелких оперонов сохраняют свою регуляцию одним и тем же регулятором. Например, оперон xylFGHR E. coli разбит в H. influenzae на два оперона, xylFGH и xylR (рис. 7). Только xylFGH поддерживает регуляцию CRP в H. influenzae . Белковые продукты генов xylF, G и H составляют высокоаффинную транспортную систему ксилозы как в геномах, так и в этой системе. xylR кодирует регуляторный белок (Sumiya et al.1995). В E. coli xylR действует как активатор транскрипции для оперона xylFGHR, а его экспрессия регулируется CRP (Song and Park 1997). В H. influenzae регуляция xylR может быть передана другому регулятору. В качестве альтернативы он мог бы регулироваться автоматически. Если это В данном случае это еще один пример несвязанной и связанной регуляций транскрипции у двух бактерий, организация с различные динамические последствия (Hlavacek and Savageau 1996).Другой пример этого второго типа изменений касается оперона E. coli galETKM. Один и тот же оперон в H. influenzae разделен на две части: galE и galTKM (рис. 6). Опять же, только galTKM все еще регулируется CRP в H. influenzae .

В-третьих, также наиболее распространенным типом изменения во время эволюции регулона является потеря членов регулона E. coli в геноме H. influenzae .Примеры включают опероны caiTABCDE, malEFG и narGHJI. Татусов и др. (1996) предположили, что общий предок E. coli и H. infuenzae мог иметь геном промежуточного размера. Дальнейшая эволюция могла идти в противоположных направлениях — в сторону редукции размера генома путем делеции генов и целых единиц транскрипции в линии Haemophilus и в сторону диверсификации регуляторных и транспортных функций посредством дупликации генов в E.coli (Татусов и др., 1996). В результате снижение количества членов регулона CRP и FNR может быть результатом дегенеративной эволюции H. influenzae. Паразитарный образ жизни H. influenzae может потребовать менее сложного метаболизма, чтобы справиться с изменениями окружающей среды. Однако в виде доли от общего числа Из генов оба вида, по-видимому, имеют регулоны одинакового размера.

Расположение регуляторных сайтов вдоль генома имеет явное влияние на то, как происходит регуляция через эти сайты (Gralla and Collado-Vides 1996).Возникает интересный вопрос: имеют ли регуляторные участки ортологичных генов идентичные или близкие положения, что остается ли расстояние между регуляторными сайтами и их регулируемыми промоторами более или менее неизменным между бактериальными разновидность. Чтобы получить такую ​​информацию, нам потребуется достаточно точный метод прогнозирования промоторов в этих организмах. К сожалению, современные методы предсказания промоторов в этом отношении неудовлетворительны.Для решения этой проблемы необходима дальнейшая работа. очень интересный вопрос.

Мы заметили, что некоторые из наших предсказанных TU имеют довольно дистальные сайты связывания. Потому что мы сообщаем положение места привязки относительно начала трансляции первого нижестоящего гена, эти большие расстояния могут быть просто результатом существования длинной 5 ‘нетранслируемой области. И наоборот, они могли бы быть истинными дистальными участками, даже если бы наши измерения были основаны на транскрипции. Начало.Из-за глобального характера регуляторных функций, контролируемые CRP и FNR TU часто имеют еще один локальный специализированный регулятор, такой как LacI для оперона lac и GalR для оперона gal. Таким образом, мы подозреваем, что предсказанные здесь ТЯ с дистальными участками покажет регулирование дополнительными белками.

Подход, который мы использовали в этой статье, позволил идентифицировать много новых генов, которые, как мы предполагаем, регулируются белками CRP и FNR. в г.coli и H. influenzae . Объединенные данные, полученные на основе оценок сайтов и сравнительного анализа, дают нам высокую уверенность во многих из этих прогнозов. Но это явно только первый шаг. Можно включить больше видов бактерий и изучить гораздо больше регулонов, хотя регулоны с несколькими известными членами более проблематичны из-за небольшого размера выборки. Точное предсказание единиц транскрипции имеет решающее значение для успеха такого подхода, так как опероны часто перестраиваются в процессе эволюции и общие регуляторные сайты могут находиться на большом и переменном расстоянии от ортологичных пар генов.В этой работе многие этапы выполнялись вручную, в том, что тщательное изучение некоторых результатов использовалось для ограничения дальнейшего анализа. Опыт, полученный в результате этой работы, будет позволяют нам разрабатывать более полностью автоматизированные процедуры, которые могут быть применены к большему количеству регуляторных систем у большего количества видов в кратчайшие сроки. и надежный подход.

МЕТОДЫ

Данные последовательности и программы

Экспериментально охарактеризовано (в основном методом ДНК-отпечатка) E.coli CRP- и FNR-связывающие последовательности были извлечены из базы данных RegulonDB (Salgado et al. 2000a). Полные последовательности генома E. coli и H. influenzae были загружены из GenBank (Benson et al. 1999). Матрицы весов были сконструированы с помощью CONSENSUS (Hertz and Stormo 1999), который генерирует оптимальное выравнивание множественных последовательностей без пробелов с заранее заданной шириной. Кроме того, программа сообщает статистическая значимость полученного множественного выравнивания последовательностей.По заданной весовой матрице ищет фактор транскрипции сайты связывания были выполнены с использованием PATSER (Hertz et al. 1990). PATSER оценивает каждое возможное положение сайта связывания в последовательности, используя указанную матрицу весов, и возвращает оценки и позиции всех сайтов выше определенного пользователем порога. Множественные выравнивания белковых последовательностей были построены с использованием программа CLUSTALX (Thompson et al.1997). Поиск в базе данных последовательностей белков выполняли с использованием программы gapped BLASTP (Altschul et al. 1997). Все поиски проводились в базе данных неизбыточных последовательностей белков Национального центра биотехнологической информации. Сравнение последовательностей между CRP и FNR E. coli проводили с использованием программы BestFit (Wisconsin Package Version 10.0; Genetics Computer Group). Логотипы последовательностей были созданы с использованием веб-интерфейса. (С.E. Brenner, http://www.bio.cam.ac.uk/cgi-bin/seqlogo/logo.cgi) до программы MAKELOGO Шнайдера (Schneider and Stephens 1990). Остальная часть анализа была выполнена с использованием специальных скриптов PERL (Wall et al. 1996).

Подготовка последовательностей обучающего набора

Текущая версия базы данных RegulonDB (версия 3.0) содержит 80 экспериментально проверенных E.coli CRP-связывающих последовательностей из 56 TU (поскольку некоторые из этих 56 TU имеют несколько сайтов связывания CRP, количество сайтов превышает количество ЕД). Мы ожидаем, что некоторые из этих 80 сайтов являются сайтами слабого связывания CRP. Предположительно, CRP связывает эти слабые сайты. через взаимодействие с другими регуляторными белками. Слабые сайты были отфильтрованы из нашей обучающей выборки с помощью следующих процедуры. На первом этапе мы запустили CONSENSUS для 80 связывающих последовательностей и сгенерировали исходную матрицу весов.Затем PATSER использовали для оценки исходных 80 связывающих последовательностей с использованием весовой матрицы, созданной на первом этапе. После этого начального На шаге мы выбрали последовательность с наивысшей оценкой из каждой Единицы для дальнейшей обработки. Это дало нам 48 сайтов, представляющих 53 ЕП (все сайты трех из 56 ЕП были отклонены КОНСЕНСУСОМ и, следовательно, не включены). Из-за существования расходящихся ЕП количество сайтов меньше, чем количество ЕП.В среднее и стандартное отклонение оценок этих 48 сайтов составили 13,1 и 3,6 бит соответственно. Для нашего последнего тренировочного набора мы исключили из 48 сайтов любые сайты с оценками, которые более чем на одно стандартное отклонение ниже среднего, то есть 9,5. биты. В итоге мы получили 42 последовательности в обучающей выборке, представляющие 46 TU.

Текущая версия базы данных RegulonDB содержит 17 экспериментально проверенных E.coli FNR-связывающих последовательностей из 13 TU. Мы применили те же процедуры к этим 17 последовательностям, чтобы сгенерировать обучающий набор. Мы закончили с девятью последовательностями в нашей обучающей выборке, представляющими девять TU. Среднее и стандартное отклонение этих девяти последовательностей составляли 19,8 и 4,5 бит соответственно.

Прогнозирование сайтов связывания факторов транскрипции

На первом этапе нашего анализа весовые матрицы для сайтов связывания CRP и FNR были сгенерированы с помощью CONSENSUS с использованием наших последовательностей обучающего набора (42 для CRP и девять для FNR).Впоследствии опубликованы аннотации всех открытых рамки считывания (ORF) в E. coli (Blattner et al. 1997) и H. influenzae (Fleischmann et al. 1995) были использованы для создания двух наборов предполагаемых регуляторных последовательностей (по одной для каждого генома), охватывающих 400 нт до и 50 nt ниже по потоку от начала каждой ORF. Эта длина была выбрана из известного распределения большой коллекции регуляторные сайты в ς ⁷⁰ промоторов (Gralla and Collado-Vides 1996).Затем PATSER использовали для сканирования наборов регуляторных последовательностей для идентификации потенциальных сайтов связывания с помощью созданных весовых матриц. на первом этапе (Герц и Стормо, 1999; Герц и др., 1990). Сообщали о потенциальных сайтах связывания, превышающих выбранные пороговые значения. В конце концов, информация об обязательном сайте была объединена. с ортологическими отношениями между TU для прогнозирования новых членов регулонов CRP и FNR. Мы классифицировали сайты привязки на две категории, основанные на их расположении по отношению к ЕП, расположенным ниже по течению или охватывающим его (1) участки, расположенные в регулирующем регион ТУ; и (2) сайты, расположенные внутри TU.Последняя категория включает два случая: внутри генов ТЯ и внутри вышестоящая область внутреннего гена.

Определение ортологии между генами

Fitch впервые ввело термин «ортолог» для генов, полученных в результате событий видообразования (Fitch 1970).В настоящее время не существует простого и идеального метода определения ортологической взаимосвязи из-за осложняющих событий. во время эволюции генома, такой как дупликация гена, потеря гена и горизонтальный перенос гена (Huynen and Bork 1998). Для нашего исследования мы использовали минимальное определение ортологии, описанное Huynen и Bork (1998): (1) ортологичные ORF между двумя сравниваемыми геномами должны быть наиболее похожими ORF взаимно; (2) сходство последовательностей между ORF должны быть статистически значимыми.В этой статье сходство последовательностей было рассчитано с помощью программы BLASTP (версия 2.0; Altschul et al. 1997). Любое выравнивание со значением E , равным 1e-15, считалось значимым для наших целей. и (3) сходство последовательностей распространяется по крайней мере на 60% одного из гены.

Прогнозирование единиц транскрипции

Прогноз TU был описан для E.coli Салгадо и соавт. (2000b). Метод основан на различиях между парами соседних генов в оперонах и парами соседних генов на границах. ТУ. Изучаемые различия заключались в расстояниях между генами и их функциональных отношениях, последние из которых обновление функциональной классификации, описанной Моникой Райли (Riley 1993; Riley and Labedan 1996). Здесь, чтобы применить метод к H. influenzae , мы унаследовали функциональную классификацию для E.coli , а затем применил метод прогнозирования ко всему геному H. influenzae , разделив его на предполагаемые TU. Таким образом, мы получили наборы ЕД, которые можно сравнивать между организмами, когда регуляторный сайт был обнаружен рядом с ортологичными генами, которые, в свою очередь, могут находиться внутри аналогичных TU.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лабораторий Stormo и Collado-Vides за содержательные обсуждения.Мы благодарим трех анонимных рецензентов за их Комментарии. Эта работа была поддержана грантом HG-00249 от Национальных институтов здравоохранения (G.D.S.), грантом 0028 от Conacyt (J.C.-V.), и Grant DE-FG02-98ER62558 от Министерства энергетики США (J.C.-V.).

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому эта статья должна быть настоящим помечено как «реклама» в соответствии с разделом 1734 Кодекса США 18 исключительно для обозначения этого факта.

Сноски

• №3 Автор, ответственный за переписку.

• ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА stormo {at} ural.wustl.edu; ФАКС (314) 362-7855.

• Статья и публикации находятся на сайте www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.149301.

• • Поступила 24.05.2000 г.
  • Принята к печати 8 февраля 2001 г.
• Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор

PAX8 при раке яичников человека связывает клональную зависимость с эпигенетической уязвимостью к ингибиторам HDAC

Существенных изменений:

1) Эффект нокаута всех трех HDAC на уровни белка PAX8 не так впечатляет, как лечение ингибиторами HDAC.Эффект — снижение уровней PAX8 на ~ 50%. Это следует обсудить, поскольку это не так убедительно, как указано. На рис. 6 показан синергизм между лечением цисплатином и ингибированием HDAC, и авторы связывают это с PAX8. Однако, поскольку ингибирование HDAC имеет довольно широкое влияние, еще не убедительно показано, что эффекты, наблюдаемые на рисунках 3 и 6, действительно опосредованы PAX8. Может ли фенотип быть обращен экзогенным введением PAX8? Экспрессировал бы кДНК PAX8 с другого промотора (например,г. лентивирусный LTR) обходить HDACi-опосредованное подавление транскрипции? Если этот механизм применим, можно ожидать некоторой степени спасения в анализах роста / подвижности, показанных на рисунке 3G-J.

Мы согласны с авторами обзора в том, что эффект нокаута HDAC1-3 на уровни PAX8 менее заметен, чем у ингибиторов HDAC. По крайней мере две причины могут привести к таким воспроизводимым результатам в двух различных клеточных линиях рака яичников. Во-первых, истощение HDAC1-3 не было полным, о чем свидетельствует низкое количество обнаруживаемых белков в Вестерн-блоттинге (Рисунок 3 — рисунок в приложении 2A).CRISPR / Cas9-опосредованное редактирование генов, как известно, содержит внутрикадровую репарацию и не может достичь 100% эффективности, особенно когда сопровождается нарушением жизнеспособности клеток из-за нокаута HDAC (пересмотренный рисунок 3 — приложение к рисунку 2B). Во-вторых, подавление PAX8 было антипролиферативным и могло быть выбрано против альтернативного механизма активации PAX8. Такой же отбор был, по-видимому, незначительным с ингибиторами HDAC, вероятно, из-за их быстрого способа действия по сравнению с генетическим подходом.

Чтобы определить, действительно ли наблюдаемые эффекты ингибирования HDAC опосредованы PAX8, мы провели исследования по спасению путем сверхэкспрессии PAX8 посредством лентивирусной трансдукции в клетках KURAMOCHI, HEY, SKOV3 и OVTOKO.В этих экспериментах были отмечены два важных вывода. Во-первых, экзогенная экспрессия PAX8 с использованием лентивирусного вектора больше не противодействовала ингибиторам HDAC, что согласуется с предложенной нами моделью эпигенетической регуляции экспрессии PAX8 молекулами HDAC. Особый интерес представляет то, что лечение панобиностатом или ромидепсином неожиданно привело к заметно повышенным уровням PAX8 в этих условиях (пересмотренный рисунок 3 — рисунок в приложении 2C), напоминающий о недавно сообщенном взаимодействии между HDAC и YAP (Han H.и др., Онкоген. 2018.). Во-вторых, ингибирующие эффекты соединений HDAC на жизнеспособность и подвижность клеток были частично обращены вспять после повторной экспрессии PAX8 (пересмотренный рисунок 3 — приложение к рисунку 2D). Взятые вместе, наши данные подтверждают роль белков HDAC в регуляции экспрессии и функции PAX8.

2) Необходимо лучше объяснить выбор моделей клеточных линий и провести валидационные эксперименты для подтверждения воспроизводимости результатов между клеточными линиями. Рисунок 5: Почему Курамочи не использовали в этих исследованиях на животных, поскольку это была одна из основных клеточных линий, используемых в исследованиях in vitro? Эффект нокаута PAX8 в клетках HEY не столь убедителен, как в клетках SKOV3 или в клетках, обработанных HDACi.На рисунке 2 используются клетки OCTOKO, в то время как экран визуализации для уровней PAX8 был выполнен в клетках KURAMOCHI. Следует включить валидационные эксперименты, показывающие, что ключевые результаты из рисунка 2 также воспроизводятся в клетках KURAMOCHI. «Сначала мы провели эксперимент с микрочипами на клетках OVTOKO, трансдуцированных малой интерферирующей РНК PAX8 (миРНК) или скремблированным контролем (рис. 2А)». Почему авторы выбрали именно эту линию клеток? OVTOKO несет в себе миссенс-мутацию PAX8 в остатке P350, что необычно и не репрезентативно в популяции.Более того, OVTOKO считается клеточной линией светлоклеточной карциномы, а не линией высокозлокачественной серозной карциномы, как KURAMOCHI, HEY и SKOV3.

Благодарим рецензентов за содержательные комментарии. В большинстве случаев для представления гистопатологически и генетически гетерогенного рака яичников использовали несколько клеточных линий (часто KURAMOCHI, HEY, SKOV3 и OVTOKO). Иногда на выбор клеточных линий влияет ряд факторов. Например, OVTOKO демонстрирует зависимость от PAX8 в большей степени, чем другие.Поэтому он был выбран для проведения первых серий экспериментов, включая профилирование микроматрицы, идентификацию регулонов и фенотипический анализ генов регулонов, чтобы получить более надежные результаты. С другой стороны, KURAMOCHI вырос в культуре и имел уникальную особенность гигантской круглой ядерной морфологии, которая хорошо подходила для высокопроизводительного экрана на основе изображений. Мы также протестировали линии клеток яичников на мышах BALB / c Nude, и только HEY и SKOV3 эффективно формировали ксенотрансплантаты. Поскольку PAX8 был идентифицирован как онкоген выживания клонов в эпителиальном раке яичников из Мюллерова тракта, для исследования подходили модели как преобладающей серозной карциномы высокой степени, так и редких моделей светлоклеточной карциномы.Мы обнаружили, что миссенс-мутация PAX8 в остатке P350 в OVTOKO, по-видимому, не связана с функциональным дефицитом PAX8 или измененной регуляцией HDAC, и, таким образом, вряд ли повлияет на наши основные выводы, все из которых были дополнительно подтверждены независимыми линиями клеток дикого типа. PAX8.

Чтобы улучшить нашу рукопись, мы применили несколько подходов, чтобы подчеркнуть экспериментальную воспроизводимость. Во-первых, фенотипический скрининг генов регулона в клетках OVTOKO (фиг. 2F) был повторен в клетках KURAMOCHI (пересмотренная фиг. 2F).Во-вторых, ослабление иммунофлуоресцентного сигнала PAX8 в обработанных панобиностатом KURAMOCHI также наблюдалось у HEY, SKOV3 и OVTOKO (пересмотренный рисунок 3 — приложение к рисунку 1B). В-третьих, фармакологическое ингибирование HDACs проводили с двумя дополнительными соединениями (пересмотренный рисунок 3 — рисунок в приложении 1C). В-четвертых, мы предоставили научное обоснование выбора клеточных линий, где это возможно.

3) Каково влияние на жизнеспособность и миграцию клеток с тройным нокаутом HDAC1-3? Более того, предполагают ли авторы, что HDAC1-3 функционирует как активаторы транскрипции локуса PAX8? Занимают ли эти белки энхансеры в локусе PAX8? Этот вопрос следует обсудить и решить экспериментально.В противном случае в этом исследовании нет реальных механистических концепций, которые помогли бы нам лучше понять феноменологию рака HDACi.

Это важный момент, и мы ценим вопросы рецензентов. Мы провели анализы пролиферации и миграции клеток и подтвердили, что клетки с тройным нокаутом HDAC1-3 демонстрируют нарушенную жизнеспособность и дефектную подвижность по сравнению с контрольными клетками (пересмотренный рисунок 3 — приложение к рисунку 2B), что соответствует наблюдаемому подавлению активности PAX8 при истощении HDAC1-3. .С механистической точки зрения, учитывая их каноническую активность гистондеацетилазы, мы пришли к выводу, что белки HDAC класса I с меньшей вероятностью будут специфически связываться с локусом гена PAX8 и функционировать как активаторы транскрипции, но скорее косвенно регулируют экспрессию PAX8, эпигенетически контролируя топологию энхансеров, меченных h4K27ac. Действительно, профили занятости h4K27ac выявили типичную суперэнхансерную область вокруг промотора PAX8 (рис. 4A), которая была нарушена после ингибирования HDAC, на что указывает непропорциональное обогащение h4K27ac внутри интронов PAX8 (рис. 4B; исправленный рисунок 4 — приложение к рисунку 1A).Поскольку суперэнхансер был характерен для многих онкогенов, выживших по клонам, они могут быть одинаково восприимчивы к эпигенетическим вмешательствам. Наши предварительные испытания NKX2-1 при аденокарциноме легкого и SOX2 при плоскоклеточном раке легкого подтвердили эту гипотезу (рис. 4 — приложение к рис. 2). Таким образом, механистическая концепция в нашем исследовании пролила новый свет на модель зависимости от клонов в раковых опухолях человека и обещала нацелить онкогены выживания клонов в часто трудно поддающихся лечению новообразованиях.Мы добавили новые данные и изменили рукопись, чтобы выделить вышеуказанный момент.

4) Поскольку эффекты ингибиторов HDAC, вероятно, распространяются на весь геном, почему PAX8 может быть затронут конкретно? Мы рекомендуем автору выполнить анализ времени, который измеряет зрелую мРНК и формирующуюся РНК после воздействия HDACi (включая контрольные всплески). Обоснование должно состоять в том, чтобы определить, действительно ли PAX8 является геном гиперчувствительности к этому лекарственному воздействию. Тепловая карта, показанная на рисунке 4 — рисунок в приложении 1C, подразумевает, что многие гены чувствительны к этому возмущению, и я думаю, что важно определить рейтинг PAX8 по сравнению со всеми другими экспрессируемыми генами в отношении его чувствительности к HDACi.

Это отличные предложения. С помощью анализа RNAseq мы идентифицировали 7693 (4442 вверх и 3251 вниз) и 7764 (4470 вверх и 3294 вниз) дифференциально экспрессируемых гена (кратное изменение> 2; скорректированное значение p <0,05), связанных с лечением панобиностатом и ромидепсином, соответственно ( Рисунок 4 - приложение к рисунку 1С). Таким образом, действие ингибиторов HDAC действительно распространяется на весь геном в раковых клетках яичников. Чтобы определить рейтинг PAX8 по сравнению с другими экспрессируемыми генами, мы приняли совет автора обзора провести анализ общей мРНК или образующейся РНК с течением времени после воздействия HDACi.К сожалению, эксперимент с зарождающейся РНК не увенчался успехом из-за технических проблем, и мы все еще пытаемся решить эту проблему. Между тем, анализ зависимости общей мРНК от времени однозначно продемонстрировал, что PAX8 входит в число генов гиперчувствительности к ингибиторам HDAC (пересмотренный рисунок 4 - приложение к рисунку 1B). Мы поняли, что эти результаты могут быть искажены стабильностью РНК, и поэтому использовали общий ингибитор транскрипции актиномицин D в качестве отрицательного контроля. Эти данные показали, что ингибирование HDAC до некоторой степени специфически влияет на экспрессию гена PAX8.

[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]

Рукопись была улучшена, но остаются некоторые проблемы, которые необходимо решить перед принятием, как указано ниже:

В контрольном письме со ссылкой на рисунок 4 — приложение к рисунку 1 утверждается, что «действительно, профили занятости h4K27ac выявили типичную область суперэнхансера вокруг промотора PAX8 (рисунок 4A), которая была нарушена после ингибирования HDAC, на что указывает непропорциональный h4K27ac. обогащение внутри интронов PAX8 (Рисунок 4B; исправленный рисунок 4 — приложение к рисунку 1A) ».

Однако, поскольку на этом рисунке не представлена ​​ось Y, нельзя сказать, действительно ли общий сигнал увеличивается, вызывая непропорциональное обогащение h4K27ac интронами PAX8 (как утверждают авторы), или же общий сигнал фактически идет вниз, и пики на промоутере PAX8 теряются. Предоставьте информацию о количестве тегов на оси Y на рисунке, чтобы вывод был лучше подтвержден визуализированными данными.

Мы благодарим рецензентов за указание на это и сбросили автоматическую ось Y на фиксированный масштаб для прямого сравнения трех условий.Интересно, что первоначально наблюдаемое относительное обогащение h4K27ac внутри интронов PAX8 при ингибировании HDAC действительно вызвано потерей пиков ChIP-seq вокруг промотора гена. Это явление оказалось широко распространенным, как показано на изображении ответа автора 1, на котором представлены метки h4K27ac, прилегающие к сайтам начала транскрипции (TSS).

Следовательно, ингибиторы HDAC могут приводить к перераспределению ацетилирования гистонов за счет соответствующей локализации.Хотя эти результаты являются неожиданными, учитывая наиболее известную функцию HDAC в качестве «стирателей» ацил-лизина, возможное механистическое объяснение состоит в том, что схема ацетилирования-деацетилирования гистонов может быть одновременно нарушена, так что сигналы h4K27ac становятся в целом плоскими по всему хроматину и топологии энхансера. следовательно возмущен. Мы изменили описание, чтобы лучше отразить данные ChIP-seq.

Rv1657 Регуляторный белок аргининового пути ArgR, репрессор регулона arg

Gene Details предоставляет информацию о генах из различных ресурсов на разных панелях.На боковой панели слева отображаются быстрые ссылки для быстрого доступа к другим ресурсам. Блок структуры и доменов включает в себя ссылки на входы UniProt, записи PDB и PM Portal, если они доступны, и информацию о субклеточной локализации. Блок SSGCID отображает запись об этом в Центре структурной геномики Сиэтла по инфекционным заболеваниям. Если запись недоступна, пользователь может отправить запрос через свой веб-сайт. В этом блоке также представлены последовательности ДНК и аминокислот.

Сводка

Обзор

Связывается с (ChIP-Seq)

Связано (ChIP-Seq)

Модули регулирования (сеть cMonkey)

Регулируется (Сеть вывода)

Регулирует (сеть вывода)

Продукт Synonmys

ПАТРИК

Туберкулист

KEGG Pathways

BioCyc Pathways

Сеть строк

RefSeq

Go Условия

Экспрессия гена

SSGCID Подробности

Данные по экспрессии гена

Профили ChIP-Seq

Панели Essentiality

Сущность холестерина

Прогнозирование регуляторных сетей генов из клеточных атласов

% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 2 0 obj > ручей Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / W Unicode2020-10-05T00: 03: 26-07: 002020-09-21T15: 41: 12 + 05: 302020-10-05T00: 03: 26-07: 00application / pdf

Рис. 4 | Потеря вакуолярной кислотности приводит к дефектам кластеров железо-сера и дивергентным гомеостатическим реакциям во время старения у Saccharomyces cerevisiae

При старении железо-серные кластеры становятся недостаточными. Активация регулона железа обратно коррелирует с дефицитом железо-серного кластера. Клетки с устойчивой активностью регулона железа во время старения обычно следуют траектории ограниченного дефицита железо-серного кластера. n = 209 ячеек. a Тенденция старения населения с недостаточностью кластера железа и серы (ядерное обогащение Rps2). Недостаточность железо-серного кластера увеличивается с возрастом. Пирсон r = 0,52, p <10 ⁻⁴ . Планки погрешностей — SEM. b График разброса недостаточности кластера железо-сера (ядерное обогащение Rps2-GFP) и активации регулона железа (флуоресценция Fit2-mRuby2) в старых клетках (все клетки и возраст> 12 делений).Спирмен ρ = — 0,26, p <10 ⁻⁴ , n = 189 (клетки, жившие 12 поколений и более). c Возрастная тенденция дефицита железо-серного кластера для железо-регулон-компетентных и некомпетентных клеток во время старения. Клетки, активные по отношению к регулону железа, определяются как имеющие максимальный уровень флуоресценции Fit2, который в 3 раза превышает средний базовый уровень. Клетки, неактивные к регулону железа, не больше нуждаются в железе в раннем возрасте, но имеют менее серьезный дефицит железо-серного кластера от среднего до пожилого возраста ( p <0.05 для возраста 15–30 лет). n _{регулятор активного железа} = 59, n _{регулятор неактивного железа} = 150. Планки погрешностей — SEM. d Единичные клеточные траектории дефицита железо-серного кластера и активности регулонов железа при старении. Во время старения клетки демонстрируют расходящиеся траектории метаболизма железа. Красный: активен регулон железа с ограниченным дефицитом кластера железо-сера.